[發明專利]一種產泰樂菌素A的重組菌株及其生產泰樂菌素的方法

在審

• 申請號: 202310240302.5
• 申請日: 2023-03-14
• 公開（公告）號: CN116333958A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 肖志宏;厲海笛;黃婷婷;林雙君;呂立獲
• 申請（專利權）人: 浙江普洛生物科技有限公司;上海交通大學;普洛藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/76;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 李茂家;閆俊萍

本公開屬于微生物和生物技術領域，具體涉及一種產泰樂菌素A的重組菌株及其生產泰樂菌素的方法。更具體來說，本公開涉及一種重組鏈霉菌、包含鏈霉菌的細胞培養物及用途，和生產泰樂菌素的方法。本公開以星海灣鏈霉菌為出發菌株，增強了星海灣鏈霉菌中泰樂菌素合成通路關鍵酶的表達，構建得到了生產泰樂菌素的重組微生物菌株T0771。利用所述重組菌株發酵生產泰樂菌素，可降低副產物泰樂菌素D的產生、使其含量降低至3％以下，并將泰樂菌素C全部轉化為泰樂菌素A，因此顯著了提升泰樂菌素A的產量及純度(≥97％)。

技術領域

本公開屬于微生物和生物技術領域，具體涉及一種產泰樂菌素A的重組菌株及其生產泰樂菌素的方法。更具體來說，本公開涉及一種重組鏈霉菌、包含鏈霉菌的細胞培養物及用途，和生產泰樂菌素的方法。

背景技術

泰樂菌素是由弗氏鏈霉菌等放線菌產生的一類大環內酯類抗生素，其結構是由一個十六元內酯環和碳霉氨基糖(mycaminose)，紅霉糖(mycarose)和6’-脫氧-D-阿洛糖(mycinose)三個糖苷配基組成。市售泰樂菌素是多組分的混合物，其中泰樂菌素A占90％，其生物活性最優。鑒于對革蘭氏陽性菌、螺旋體、支原體等都有優良的生物活性，泰樂菌素不僅被作為動物飼料藥物添加劑，也可作為半合成原料，用于生產活性更好、附加值更高的替米考星和泰萬菌素等衍生物，具有良好的國內和國際市場前景。

泰樂菌素主要是通過微生物發酵合成。在發酵過程中，存在四種主要成分：泰樂菌素A，去碳霉糖的泰樂菌素B，泰樂菌素C(大菌素)和泰樂菌素D(雷洛菌素)，其中泰樂菌素A為藥效組分。在發酵初期，以泰樂菌素A為主。隨著發酵時間的延長，A和C的組分比例發生變化，即C組分不斷增加，由此推測C組分轉化為A組分的酶活力不強，造成了C組分的積累。故在發酵后期需要將C定向轉化為A。此外，泰樂菌素發酵液中的雜質組分泰樂菌素D一直是困擾泰樂菌素產品純度的難點。泰樂菌素D與泰樂菌素A性質相近、難以消除，也為后續半合成泰樂菌素衍生物引入了雜質，而額外增加純化分離步驟將提高成本。

常規的菌株選育和復壯是維持和提升菌株效價的通用策略。例如，引用文獻1中公開了一株通過誘變即定向篩選到的弗氏鏈霉菌SF-4，通過在該菌株的發酵過程中添加銨鹽的方法，從而促進了泰樂菌素C組分轉化為A組分。此外，在深入研究泰樂菌素生物合成機制的基礎上，利用生物技術體系，從基因水平對生產菌株進行遺傳改造，提升限速步驟的基因表達水平。引用文獻2以泰樂菌素生產菌株弗氏鏈霉菌SWL00020為出發菌株，通過敲除其基因組中的基因tylCVII、tylCV、tylCVIII、tylCIV和tylCII，實現了只產泰樂菌素B而不產泰樂菌素A。引用文獻3中公開了在弗氏鏈霉菌TL-209中轉入過表達泰樂菌素合成關鍵限速酶基因tylF以及透明顫菌血紅蛋白基因vhb的重組質粒，并將重組菌株于30L發酵條件下發酵，泰樂菌素產量可達到17000～18000u/mL，泰樂菌素A組分的含量可達到94％～95％。

目前泰樂菌素通常是通過微生物發酵獲得，雜質組分泰樂菌素C和D在發酵過程中產生并積累，需要通過提高溫度，將泰樂菌素C完全轉化為泰樂菌素A，且在此過程中泰樂菌素D進一步增加，通常在5％以上，影響了產品純度，不符合泰樂菌素市場要求(≤3.5％)。鑒于泰樂菌素多組分的產生通常源于生物合成途徑中的后修飾基因(圖1)，后修飾基因的表達水平低會導致中間產物的積累，而影響最終產物的產量。因此針對限速的后修飾基因進行合理改造優化，將有望實現有效組分泰樂菌素A的產量提升，同時降低其他雜質組分。

引用文獻：

引用文獻1：CN111139197A；

引用文獻2：CN103849591A；

引用文獻3：CN102690775A。

發明內容

發明要解決的問題