[發(fā)明專利]一種基于超高效液相色譜法檢測微藻中炔雌醇的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310239413.4
• 申請日: 2023-03-13
• 公開（公告）號: CN116297949A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王振;吳小敏;王裕文;劉曉娟
• 申請（專利權(quán)）人: 汕頭大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/86
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 廖奇麗

本發(fā)明屬于雌激素檢測領(lǐng)域，具體公開了一種基于超高效液相色譜法檢測微藻中炔雌醇的方法。該方法采用超高效液相色譜法梯度洗脫程序進(jìn)行檢測；其中：梯度洗脫程序?yàn)椋??2.5min時(shí)使用10％的甲醇，2.5?5min時(shí)使甲醇比例上升到40％，5?7.5min持續(xù)使用40％甲醇，7.5?8min使甲醇比例上升到90％，8?17min持續(xù)使用90％甲醇，17?17.5min使甲醇比例下降到10％，運(yùn)行至20min，結(jié)束。本發(fā)明采用超高液相色譜法對微藻中的炔雌醇進(jìn)行檢測，通過設(shè)置特定的梯度洗脫程序，以高效檢測并定量微藻中的炔雌醇及其產(chǎn)物；并根據(jù)比對炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，空白的色譜圖中的峰，從而預(yù)測炔雌醇可能的降解產(chǎn)物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于雌激素檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于超高效液相色譜法檢測微藻中炔雌醇的方法。

背景技術(shù)

炔雌醇(EE2)由雌酚酮經(jīng)乙炔化制成，含有炔基，在乙醇、丙醇、甲醇或乙醚中易溶，在水中不溶。目前，大多采用乙酸乙酯萃取法來萃取炔雌醇，乙酸乙酯法是取2mL培養(yǎng)物加入1mL乙酸乙酯并振蕩1分鐘，然后將混合物以2000rpm離心15秒以收集有機(jī)層，水層每次用1mL乙酸乙酯萃取四次，收集所有有機(jī)層；有機(jī)層用無水硫酸鈉脫水，在45℃下用氮?dú)飧稍锊⑷芙庠?00μL乙腈中，得到色譜檢測的樣品(參見Peng?W,Fu?Y,Jia?B,Sun?X,Wang?Y,Deng?Z,Lin?S,Liang?R.Metabolism?analysis?of?17α-ethynylestradiol?byPseudomonas?citronellolis?SJTE-3and?identification?of?the?functional?genes.JHazard?Mater.2022Feb?5；423(Pt?A):127045.doi:10.1016/j.jhazmat.2021.127045.Epub?2021Aug?30.PMID:34488099)。檢測樣品的技術(shù)有采用HPLC(高效液相色譜法)檢測和GC-MS(氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用)檢測，而GC(氣相色譜法)樣品前處理還需要多一個(gè)樣品衍生化的步驟來增加樣品的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，HPLC檢測條件為205nm波長，柱溫35℃，使用不同比例的水和乙腈作流動(dòng)相；GC-MS檢測條件為氦氣載氣，程序升溫，ESI電子源，電子轟擊能力70eV，全掃描模式(m/z?50-500)(參見Ye?X,Wang?H,KanJ,Li?J,Huang?T,Xiong?G,Hu?Z.A?novel?17β-hydroxysteroid?dehydrogenase?inRhodococcus?sp.P14?for?transforming?17β-estradiol?to?estrone.Chem?BiolInteract.2017Oct?1；276:105-112.doi:10.1016/j.cbi.2017.06.010.Epub?2017Jun13.PMID:28619386)。

因此，現(xiàn)有技術(shù)中采用乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取培養(yǎng)物中的炔雌醇，還需通過真空干燥濃縮后，加有機(jī)相水相復(fù)溶得到樣品，過程太繁雜耗時(shí)，易于流失樣品，增大誤差；而氣相色譜分析樣品前處理需衍生化，過程繁雜且危險(xiǎn)性較大。液相色譜非梯度洗脫方法檢測出的化合物種類較少，不能有效分離炔雌醇。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種基于超高效液相色譜法檢測微藻中炔雌醇的方法，該方法先通過甲醇溶劑反應(yīng)炔雌醇暴露后的微藻液，外加渦旋破碎細(xì)胞，甲醇得以快速有效萃取出微藻細(xì)胞中的炔雌醇；然后通過超高效液相色譜梯度洗脫程序與多波長檢測盡可能多的檢測出炔雌醇的疑似代謝產(chǎn)物，高效檢測并定量炔雌醇及其產(chǎn)物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一方面提供了一種檢測微藻中炔雌醇的方法，采用超高效液相色譜法梯度洗脫程序進(jìn)行檢測；所述梯度洗脫程序?yàn)椋?-2.5min時(shí)使用體積濃度為10％的甲醇，2.5-5min時(shí)使甲醇濃度上升到40％，5-7.5min持續(xù)使用40％甲醇，7.5-8min使甲醇濃度上升到90％，8-17min持續(xù)使用90％甲醇，17-17.5min使甲醇濃度下降到10％，運(yùn)行至20min，結(jié)束。