[發明專利]基于酶輔助固相微萃取熒光響應傳感器、制備方法和應用

在審

• 申請號: 202310234906.9
• 申請日: 2023-03-13
• 公開（公告）號: CN116559423A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 陳一桐;孔德昭;顧一丹;陶春旭;唐盛;沈薇;劉暢;史巧巧
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64;G01N33/53;G01N33/551
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發明公開了基于酶輔助固相微萃取熒光響應傳感器、制備方法和應用，所述傳感器包括表面依次經羥基化和氨基化的石英棒，羧基修飾的2GDNA序列；其中，2GDNA序列偶聯在石英棒表面，2GDNA序列為SEQ?ID?NO.1。優點在于：(1)本發明在固相微萃取探針上設計了反應單元和熒光檢測單元兩個模塊，有利于減少實驗干擾，去除基質效應，提高反應速率；(2)所述方法所需樣品量較少，且無需繁雜的前處理提取過程；(3)本發明將樣品中抗生素的含量轉化為熒光儀器的熒光強度值，檢測方法操作簡單便捷，檢測迅速，運用適用于高靈敏快速檢測分析，不需要進行單熒光素修飾，無需修飾猝滅劑，具有成本低的優點。該方法使用熒光光譜儀進行熒光信號檢測，鏈霉素的檢出限為0.01084nM。

技術領域

本發明屬于食品安全分析技術領域，涉及核酸適配體親和捕獲反應與Nt.BstNBI酶剪切與雜交鏈式反應引發熒光信號檢測方法，具體為基于酶輔助固相微萃取熒光響應傳感器、制備方法和應用。

背景技術

養蜂業中常用的抗生素包括氯霉素、四環素、鏈霉素等，抗生素在治療蜜蜂疾病的同時，無法代謝完全的抗生素就會殘留在蜂蜜中，影響蜂蜜食品的質量。

現有技術中的抗生素分析方法包括熒光法、色譜-質譜聯用法、比色法、化學發光法、酶聯免疫吸附法、免疫層析法和電化學法等。近年來，生物傳感器結合了表面等離子體共振(SPR)、熒光、比色、電化學傳感器技術，被認為是一種強大的分析測試工具，許多生物傳感技術被開發出來，以提供經濟、便捷和靈敏的抗生素檢測平臺。雖然這些分析方法已經對抗生素實現了檢測，但這些方法仍然有許多局限性，如操作過程復雜、靈敏度低，以及檢測方法特異性不足。而開發高選擇性、高靈敏度的抗生素檢測方法對蜂蜜食品安全至關重要。核酸具有良好的功能化和生物相容性，它可以作為基底或者生物傳感器信號介質。通常核酸傳感利用寡核苷酸之間嚴格的堿基互補配對和特異性的親和力，例如通過SELEX技術篩選出的核酸適配體，對于臨床監測、食品污染物檢測、環境污染分析物的特異性結合，核酸常用于高通量度、高靈敏和高特異性分析檢測中，可分為酶促信號轉化和非酶促信號轉化。酶促信號釋放方法具有特異性強和高穩定性的特點，例如Nt.BstNBI切刻內切酶特異性切割雙鏈DNA底物其中一條單鏈作為功能信號分子；非酶促信號釋放可在無生物酶分子的參與下，利用核酸分析之間熵值差異，例如DNA之間的結合競爭，實現信號釋放。

石英玻璃材料由于屬于SiO₂材料具有穩定性和特異性功能化，應用于核酸生物傳感探針制備可以顯著提高核酸生物傳感探針的性能，可用于制備固相微萃取探針。固相微萃取探針在實驗室具有良好的兼容性，具有試劑和樣品消耗低、實時檢測、分析平臺小型化、檢測方便和價格低廉等優點，在生物傳感器研究中具有重要意義。

發明內容

解決的技術問題：為了克服現有技術的不足，本發明利用G四鏈體二聚體序列與ThT結合熒光信號的差異，當存在STR時，STR被Aptamer捕獲，剩余的Aptamer與石英棒傳感器表面核酸序列互補結合。利用Nt.BstNBI酶輔助剪切互補雙鏈的特定位點并釋放G四鏈體二聚體序列，進行高靈敏檢測。在本發明的檢測策略中，僅G四鏈體二聚體作為熒光標記物，不需要其他猝滅劑，大大降低了經濟成本。鑒于此，本發明提供了基于酶輔助固相微萃取熒光響應傳感器、制備方法和應用。

技術方案：基于酶輔助固相微萃取熒光響應傳感器，所述傳感器包括表面依次經過羥基化和氨基化的石英棒，羧基修飾的2GDNA序列；其中，2GDNA序列偶聯在石英棒表面，2GDNA序列為SEQ?ID?NO.1：5’-TTTTTGAGTCACGACCCGACAGAGGGCGGGATGGGGGGTTGGGCGGGATGGG-3’。

優選的，所述傳感器在鏈霉素存在的環境中，鏈霉素被核酸適配體SEQ?ID?NO.2(序列為：5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGTGACTC-3’)捕獲，過量的適配體與傳感器表面的2GDNA序列互補結合，利用切刻內切酶Nt.BstNBI輔助剪切互補雙鏈釋放G四鏈體二聚體序列，G四鏈體二聚體序列與ThT結合，實現熒光增強響應。