[發明專利]用于基因多態性檢測的探針設計方法、檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202310232760.4
• 申請日: 2023-02-28
• 公開（公告）號: CN116536395A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 申耘;吳曉衛;田潔
• 申請（專利權）人: 深圳市朗瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811;C12Q1/6858;C12Q1/6876;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市特訊知識產權代理事務所(普通合伙) 44653
• 代理人: 吳汗

本發明公開了一種用于基因多態性檢測的探針設計方法、檢測方法和試劑盒，方法包括:獲取具有多態性區域的靶基因序列；將所述靶基因序列中的高度保守區作為引物結合區，將具有多態性位點的區域作為擴增區，設計與所述靶基因序列對應的若干個檢測對，其中，每一個所述檢測對包括上游引物、下游引物和探針序列，所述探針序列對應的結合區域覆蓋至少一個所述多態性位點，且所述探針序列與所述靶基因序列存在非匹配位點；基于預設的篩選規則，對所述探針序列進行篩選，得到與所述多態性區域對應的目標探針。本發明能夠提高對于基因多態性檢測的精確度，減少漏檢的發生，同時有效提高檢測效率、減少探針使用數量、提高單管檢測通量。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，特別涉及一種用于基因多態性檢測的探針設計方法、檢測方法和試劑盒。

背景技術

基因多態性是指在同一物種的某個特定基因座上存在有2個或2個以上等位基因的現象，其本質是等位基因之間在DNA序列上存在差異。造成這種DNA序列差異的主要原因包括單堿基的置換、缺失、插入，以及短片段DNA序列的插入和缺失等。現代醫學研究發現，基因組中的多態性現象與不同個體對同一疾病的易感性，以及同一種藥物對不同個體的有效性、安全性差異均有密切的關系。因此對于基因多態性的檢測具有廣泛的應用前景。

熔解曲線(Melting?curve)是指隨溫度升高DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。熔解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。基于熔解曲線的特點，在實時熒光PCR之后引入熔解曲線分析步驟，通過熔解溫度(Tm)的不同來對不同的PCR擴增產物進行區分。常見的有高分辨率熔解曲線分析法(high?resolution?melting?analysis,HRM)，多色探針熔解曲線分析法(multicolor?melting?curve?analysis,MMCA)。HRM對于熒光PCR儀器溫度控制的分辨率要求很高，且使用熒光染料只能利用到儀器中的一個熒光通道，對于檢測通量產生了很大的限制。MMCA在面對同一多態性位點上存在多種突變類型的情況時，則缺少對每一種突變類型都進行明確區分的能力，而當面對多個多態性位點在靶序列上的位置十分接近的情況時，這些多態性位點彼此之間的干擾也極大的限制該技術的應用。

為此，也有很多人提出了在這兩種技術上的改進，例如CN?101871007B公開了一種用標記探針進行檢測和熔解曲線分析的方法，但是該技術方案需要不具5’端核酸酶活性的熱穩定DNA聚合酶，對技術的使用存在限制，同時，該技術的自淬滅寡核苷酸探針設計時均針對敏感型序列進行設計，對既有敏感型又有耐藥型結核分支桿菌存在的臨床樣本進行檢測時容易發生漏檢，也無法在各種耐藥型靶序列之間進行明確的區分。再例如CN111850154A公開了一種多重熒光PCR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態性的試劑盒，該技術針對每個耐藥基因的野生型序列設計1條自淬滅寡核苷酸探針，從而存在以下問題：

1)gyrA基因的野生型存在2種序列，因此其檢測探針與不同野生型靶序列雜交時產生的Tm不同，從而導致gyrA基因野生型的Tm值是一個較大的溫度區間(43℃～51℃)；2)gyrA基因和23S?rRNA基因的突變型均有多種突變類型，且突變位點十分接近，該方法所使用的探針無法對這些突變類型之間進行區分，因此只能在HEX通道熔解峰Tm值小于50℃時籠統的判斷23S?rRNA基因有突變，在FAM通道熔解峰Tm值小于43℃時籠統的判斷gyrA基因有突變，但無法給出具體突變信息。

基于與CN?101871007?B相同的原理，該方法的檢測容易發生漏檢，在檢測混合感染樣本時，可能由于野生型靶序列對探針的結合效果更佳而導致對突變型靶序列的漏檢，當在耐藥菌株在樣本中的占比不足50％時，發生的可能性更高。因此，采用熔解曲線對基因多態性進行檢測仍然存在檢測結果精確度低等問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于采用熔解曲線對基因多態性進行檢測時檢測結果仍然精確度較低，針對現有技術的不足，提供一種用于基因多態性檢測的探針設計方法、檢測方法和試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：