[發明專利]一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202310230440.5
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116286980A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 李雷;李娜;董一潔;艾康;陳秀麗
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明屬于動物模型構建和鈣離子檢測分析技術領域，具體涉及一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法及其應用。具體的，本發明利用tol2轉基因系統，在GCaMP6s報告基因的前面加一段心肌組織中特異性表達的啟動子序列(myl7)，構建了心肌特異表達鈣離子濃度的指示探針品系魚，可以在心肌組織中表達熒光探針，結合斑馬魚活體成像技術，實時監測心肌組織中鈣離子的濃度情況，因此可用于研究生物體心肌細胞鈣信號的變化、系統的生理功能和發育機制以及相關藥物篩選，因此具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發明屬于動物模型構建和鈣離子檢測分析技術領域，具體涉及一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法及其應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

GCaMP6s是單個綠色熒光蛋白(GFP)、鈣調蛋白(CaM)和平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈激酶片段M13融合的產物。其中GFP是環狀序列改變的增強型綠色熒光蛋白(EGPF)，用六肽GGTGGS將EGFP的N末端與C末端連接起來，同時將EGFP氨基酸序列上特定位置的肽鍵斷開，產生新的N末端與C末端。C末端結合CaM，N末端結合M13片段，作為CaM結合的靶序列。

CaM結合鈣離子后發生變構，環繞在M13肽周圍，以其鉸鏈區和M13結合，Ca²⁺-CaM-M13相互作用，引起EGFP生色基團環境改變，從而使GCaMP6s的熒光強度明顯增加，發出綠色熒光。CaM和M13的結合與鈣離子結合相偶聯。與基因編碼的其他鈣離子指示劑(如GCaMPs、GCaMP3、GCaMP5s等)相比，GCaMP6s的動力學更快、靈敏度更高，適合低頻信號的指示。GCaMP6s蛋白的這種物理性質使其可以報告鈣離子的濃度。但是發明人發現，鮮有基于上述熒光蛋白特性在斑馬魚中對心肌細胞鈣信號等進行研究的相關報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法及其應用。本發明成功構建了一種心肌特異表達鈣離子濃度的指示探針品系斑馬魚，其可以在心肌組織中表達熒光探針，同時結合斑馬魚活體成像技術，能夠實時監測心肌組織中鈣離子的濃度情況。基于上述研究成果，從而完成本發明。

為了實現上述目的，本發明涉及以下技術方案：

本發明的第一個方面，提供一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法，所述方法包括：

S1、構建重組質粒myl7:GCaMP6s-CAAX，具體的，以轉座載體pTol2為骨架，將myl7-GCamp6s片段插入其中獲得；

S2、將上述重組質粒myl7:GCaMP6s-CAAX與Tol2轉座酶mRNA轉入斑馬魚胚胎，篩選并鑒定得穩定遺傳的轉基因斑馬魚品系即為斑馬魚心肌特異表達鈣離子指示探針品系(Tg(myl7:GCaMP6s))。

本發明的第二個方面，提供上述構建方法在斑馬魚鈣成像分析及鈣離子濃度監測中的應用。

本發明的第三個方面，提供一種斑馬魚心肌組織鈣成像分析及鈣離子濃度監測的方法，所述方法包括：

S1、將攜帶有GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎首先置于2,3-丁烷二酮一肟溶液中，然后再擺放入甲基纖維素中；

S2、選擇特定激發光波長并設定延時成像條件參數，對步驟S1處理后的斑馬魚胚胎的心臟區域進行延時成像；

S3、對上述攜帶有GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚胚胎心臟處Ca²⁺濃度進行定量分析。