[發明專利]一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202310230440.5
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116286980A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 李雷;李娜;董一潔;艾康;陳秀麗
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一種斑馬魚心肌特異表達鈣離子信號指示探針品系的構建方法，所述方法包括：

S1、構建重組質粒myl7:GCaMP6s-CAAX，具體的，以轉座載體pTol2為骨架，將myl7-GCamp6s片段插入其中獲得；

S2、將上述重組質粒myl7:GCaMP6s-CAAX與Tol2轉座酶mRNA轉入斑馬魚胚胎，篩選并鑒定得穩定遺傳的轉基因斑馬魚品系即為斑馬魚心肌特異表達鈣離子指示探針品系。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟S1中，

GCamp6s基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

myl7基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

所述重組質粒myl7:GCaMP6s-CAAX的核苷酸序列如SEQ.ID?NO?3所示。

3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟S2中，篩選并鑒定的具體方法包括：

利用熒光顯微鏡斑馬魚胚胎進行篩選，在胚胎內表達綠色熒光蛋白的個體被認定為疑似F0個體，飼養疑似F0個體至具備繁殖能力，并將具備繁殖能力的F0代個體與野生型個體進行交配，獲得F1代個體；利用熒光顯微鏡對F1代個體進行篩選，篩選出在心肌細胞內表達綠色熒光蛋白的個體，確定F1代陽性個體，并通過western?blot鑒定GCaMP6s基因是否插入到F1代陽性個體基因組中，以便得到穩定遺傳的轉基因斑馬魚品系。

4.權利要求1-3任一項所述構建方法在斑馬魚鈣成像分析及鈣離子濃度監測中的應用。

5.一種斑馬魚心肌組織鈣成像分析及鈣離子濃度監測的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、將攜帶有GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎首先置于2,3-丁烷二酮一肟溶液中，然后再擺放入甲基纖維素中；

S2、選擇特定激發激光波長并設定延時成像條件參數，對步驟S1處理后的斑馬魚胚胎的心臟區域進行延時成像；

S3、對上述攜帶有GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚胚胎心臟處Ca²⁺濃度進行定量分析。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中，所述攜帶有GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚(Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS))胚胎通過如下方法獲得：

將權利要求1-3任一項所述構建方法獲得的Tg(myl7:GCaMP6s)與Tg(myl7:DsRed2-NLS)的成年魚系經交配后獲得受精卵，所述受精卵發育至3-4dpf時，在體視熒光顯微鏡下挑選出攜帶GCaMP6s和DsRed表達的斑馬魚胚胎至4dpf時進行成像。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中，

分別使用488nm和561nm的激光分別激發位于斑馬魚胚胎心肌細胞的GCaMP6s和位于心肌細胞核DsRed；

延時成像條件參數包括：選擇實驗類型：Time?Series，設置Interval:0.01ms；Duration:5s；Expore?Time:15ms；兩個熒光通道參數一致并分別延時成像；最終實際圖像時間間隔為60ms。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中，

使用ImageJ對Tg(myl7:GCaMP6s,myl7:DsRed-NLS)胚胎的心臟處Ca²⁺濃度進行定量分析。

9.權利要求1-3任一項所述構建方法或權利要求5-8任一項所述斑馬魚心肌組織鈣成像分析及鈣離子濃度監測的方法在如下任意一種或多種中的應用：

(a)生物體相關基礎研究；

(b)心血管系統藥物篩選。

10.如權利要求9所述應用，其特征在于，所述(a)中，生物體相關基礎研究包括生物體心肌細胞鈣信號的變化、生物體心血管系統的生理功能和生物體發育機制研究；進一步的，所述生物體為斑馬魚。