[發明專利]一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法及應用

在審

• 申請號: 202310228127.8
• 申請日: 2023-03-10
• 公開（公告）號: CN116283992A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 胡時開;胡培松;來長凱;唐紹清;焦桂愛;王玲;謝黎虹;圣忠華;魏祥進;邵高能;趙鳳利
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C07D475/04
• 分類號: C07D475/04;G01N1/28;G01N1/40;G01N1/38;G01N33/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法，其特征在于，通過EP管利用三酶法微量提取稻米總葉酸，按照以下步驟、在弱光條件下進行：

（1）稱取米粒0.2g，裝入2.0mL?EP管；

（2）配制濃度為0.05mol/L、pH值為6.8的磷酸緩沖液，在使用前加入質量體積百分比為1%的抗壞血酸鈉和體積百分比為0.1%的β-巰基乙醇，充分溶解混勻，得提取緩沖液；

（3）向EP管內加入新制的提取緩沖液，沸水浴孵育10min，冰上迅速冷卻；

（4）加入1枚5mm鋼珠到EP管內，利用研磨機將米粒研磨至勻漿；

（5）向勻漿中依次加入α-淀粉酶10μL和提取緩沖液，渦旋混勻，室溫靜置10min；

（6）加入60μL（10mg/mL）蛋白酶液，渦旋混勻，置于37℃水浴孵育1h；

（7）取出，置于沸水浴10min以終止酶反應，冰上迅速冷卻；

（8）4℃、14000rpm離心10min，小心吸取上清液，向上清液中加入3%體積比的“大鼠血清”，渦旋混勻，置于37℃水浴孵育2h；

（9）取出，置于沸水浴10min已滅活，冰上迅速冷卻；

（10）4℃、14000rpm離心15min，小心吸取上清液，即得“稻米樣品葉酸提取物”，分裝至避光無菌管中可直接測定或凍存于-80℃備用。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中磷酸緩沖液由NaH₂PO₄?2H₂O和Na₂HPO₄?12H₂O配制的。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（3）和步驟（5）在提取糙米時加入的提取緩沖液均為750μL，在提取精米時加入的提取緩沖液依次分別是1000μL和500μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（4）研磨頻率為70Hz，提取糙米研磨時間為300s、提取精米研磨時間為240s。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（5）加入α-淀粉酶是來自于米曲霉且≥800FAU/g，步驟（6）加入的蛋白酶是來自灰色鏈霉菌且≥3.5unite/mg。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（8）中加入大鼠血清是無菌采血的并經過活性炭吸附：將大鼠血清提前從-20℃取出至4℃緩慢解凍且混勻，無菌條件下按照10:1的體積質量比加入經高溫滅菌干燥的活性炭粉末，渦旋震蕩15s混勻，置于冰浴1h，間隔混勻3～5次，4℃、14000rpm離心15min，無菌條件下吸取上清液后使用0.22μm無菌濾膜過濾，分裝濾液至無菌EP管，保存于-20℃備用。

7.根據權利要求1所述的方法的應用，其特征在于，所述提取的稻米總葉酸利用微生物法測定其含量。