[發明專利]一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法及應用

在審

• 申請號: 202310228127.8
• 申請日: 2023-03-10
• 公開（公告）號: CN116283992A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 胡時開;胡培松;來長凱;唐紹清;焦桂愛;王玲;謝黎虹;圣忠華;魏祥進;邵高能;趙鳳利
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C07D475/04
• 分類號: C07D475/04;G01N1/28;G01N1/40;G01N1/38;G01N33/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發明公開了一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法及應用。（1）稱取米粒裝入EP管；（2）配制提取緩沖液；（3）向EP管內加入新制的提取緩沖液，沸水浴孵育，迅速冷卻；（4）加入鋼珠到EP管內，將米粒研磨至勻漿；（5）依次加入α?淀粉酶和提取緩沖液，渦旋混勻，室溫靜置；（6）加入蛋白酶液，渦旋混勻，置于37℃水浴孵育1h；（7）沸水浴終止反應，迅速冷卻；（8）離心吸取上清液，加入大鼠血清，渦旋混勻，37℃水浴孵育；（9）沸水浴滅活，迅速冷卻；（10）離心吸取上清液，即得稻米樣品葉酸提取物，分裝至避光無菌管中可直接測定或凍存于?80℃備用。本發明微量、穩定、準確，省時省力、效率高，成本低。

技術領域

本發明屬于稻米品質分析技術領域，具體涉及一種通過EP管利用三酶法微量、穩定提取稻米葉酸的方法及其在微生物法葉酸測定中的應用。

背景技術

葉酸是一種水溶性B族維生素，化學名稱為蝶酰谷氨酸，也稱為VB₉、VB₁₁、維生素Bc、維生素M，分子式為C₁₉H₁₉N₇O₆，是四氫葉酸及其系列衍生物的總稱。葉酸在人類營養和健康方面具有關鍵作用：參與調節胚胎神經細胞發育來預防新生嬰兒患先天性神經管缺陷癥；作為抑郁癥患者的輔助治療劑從而緩解精神壓力；治療慢性萎縮性胃炎以及防治心肌損傷和心肌梗塞等疾病；缺乏時有引發直腸癌的危險；還可能與阿爾茨海默病以及智力下降有關。人類自身不能合成葉酸，只能依賴食物來攝取；作物是人類的主要食物，水稻又是主要的糧食作物；稻米為世界大部分人口提供每日攝入熱量的80％，但其必需微量元素含量較低，絕大多數水稻品種葉酸含量也偏低。

生物體內葉酸的代謝過程較為復雜，葉酸是介導一碳單位轉移反應的重要輔助因子，廣泛參與生物體內核酸、氨基酸和泛酸鹽等重要代謝反應及植物木質素形成和光呼吸等過程。葉酸對光敏感、易氧化、易破壞且常溫難保存；不同植物中葉酸含量存在較大差異，綠葉蔬菜、水果和豆類的葉酸含量較高，而禾谷類作物的葉酸含量較低。不同物種中葉酸的穩定提取尤其是葉酸含量偏低的稻米中的總葉酸提取具有一定困難。

葉酸提取的質量高低直接影響到總葉酸及其各衍生物組分測定結果的準確性，是首要的關鍵問題。目前，植物葉酸的提取方法主要有單酶法、三酶法、超聲波萃取法等。單酶法適用于碳水化合物和蛋白較少的組織樣品，能夠有效提取菠菜等綠葉類組織及黃瓜、卷心菜和香蕉等食物中的葉酸；三酶法相對于單酶法能夠更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基質的葉酸，常用于豆類、谷物類等種子的葉酸提取且效率較高；而超聲波提取法則較常用于葉酸片中的葉酸提取。可見，對于不同植物和組織的葉酸提取，需要擇優方法，不可盲目使用。稻米主要含有水分、碳水化合物（淀粉、纖維素、半纖維素和可溶性糖等）、蛋白質、脂類（脂肪和類脂）、礦物質和維生素等，目前專門針對稻米總葉酸提取的方法還未見報道。目前，稻米總葉酸提取只能參考其他植物和動物甚至是食品的方法來進行，導致現有的稻米葉酸測定存在許多問題，如現有測定方法需要樣品量大，測定程序中使用的耗材規格大導致精準度低，整個流程所需儀器數量多且費時費力、效率低下等等，無法滿足當前高葉酸水稻品種選育和高葉酸稻米產品研發高效檢測需求。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法及應用。

本發明采取的技術方案是：

一種微量、穩定的稻米總葉酸提取方法，通過EP管利用三酶法微量提取稻米總葉酸，按照以下步驟、在弱光條件下進行：

（1）稱取米粒0.2g，裝入2.0mL?EP管；

（2）配制濃度為0.05mol/L、pH值為6.8的磷酸緩沖液，在使用前加入質量體積百分比為1%的抗壞血酸鈉和體積百分比為0.1%的β-巰基乙醇，充分溶解混勻，得提取緩沖液；

（3）向EP管內加入新制的提取緩沖液，沸水浴孵育10min，冰上迅速冷卻；

（4）加入1枚5mm鋼珠到EP管內，利用研磨機將米粒研磨至勻漿；