[發明專利]一種用于改善卵母細胞質量的自體線粒體

在審

• 申請號: 202310218532.1
• 申請日: 2019-02-25
• 公開（公告）號: CN116355843A
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 梁曉燕;方叢
• 申請（專利權）人: 梁曉燕;方叢
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/075
• 代理公司: 北京騰遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11608
• 代理人: 劉海鵬

1.一種用于改善卵母細胞質量的自體線粒體，其特征在于，包含骨髓間充質干細胞的線粒體；所述卵母細胞的線粒體功能差；所述骨髓間充質干細胞的線粒體是通過以下步驟進行提取：

S1)復蘇骨髓間充質干細胞，進行消化處理；消化后，骨髓間充質干細胞收集到容器中；

S2)離心棄上清，再向容器中加入PBS緩沖液進行重懸；骨髓間充質干細胞懸浮后，離心棄上清；

S3)向容器中加入預冷的Mito-CytoBuffer進行重懸，重懸后轉移至另一容器中，并放入冰塊；對骨髓間充質干細胞混合液進行多次抽吸；

S4)將骨髓間充質干細胞的勻漿物轉移到另一容器中，離心、收集上清液；

S5)對步驟S4收集的上清液繼續離心，收集上清液；

S6)重復步驟S5；

在步驟S1之前還包括：骨髓間充質干細胞的分離、接種；所述骨髓間充質干細胞的分離、接種的具體步驟包括：

1)在骨髓血樣中加入PBS混勻，用離心管分裝2管ficoll淋巴細胞分離液，將稀釋骨髓緩慢加入ficoll液面上，水平離心機進行離心；

2)從界面上取出的MNC并加入離心管內；

3)加入PBS重懸，離心后棄上清；重復一次該步驟，并細胞計數；

4)將細胞種入六孔板中，每孔加培養液，細胞密度不少于2×10⁵/孔；

5)在CO₂體積分數5％、濕度95％以上和溫度37℃條件下培養箱中靜置培養，3～5天更換一次培養液；

6)待每孔細胞匯合度為80％～90％時，棄去培養液，用適量PBS液洗滌2次；

7)用EDTA胰蛋白酶，消化后終止胰酶作用；

8)用吸管反復吹打后將細胞收集于離心管中，加PBS，并離心，棄去上清；

所述藥物中骨髓間充質干細胞的線粒體DNA拷貝數為4000～5000個。