[發(fā)明專利]哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示質(zhì)粒、細(xì)胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測方法及應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202310204624.4 | 申請日: | 2023-03-06 |
| 公開(公告)號(hào): | CN116286977A | 公開(公告)日: | 2023-06-23 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 鮑凌志;潘家潔;楊愛珍;馬潔;趙國平;陳少鵬 | 申請(專利權(quán))人: | 皖南醫(yī)學(xué)院 |
| 主分類號(hào): | C12N15/85 | 分類號(hào): | C12N15/85;C12N5/10;G01N33/68;G01N33/569;G01N15/14;C12N15/10;G01N21/64;C07K16/24;C12R1/91 |
| 代理公司: | 蕪湖安匯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34107 | 代理人: | 任晨晨 |
| 地址: | 241002 安徽省*** | 國省代碼: | 安徽;34 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 哺乳動(dòng)物 細(xì)胞 表面 展示 質(zhì)粒 細(xì)胞系 抗體 檢測 方法 高產(chǎn) 細(xì)胞株 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示質(zhì)粒、細(xì)胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測方法及應(yīng)用,本發(fā)明將蛋白分泌信號(hào)肽、抗體Fc片段結(jié)合肽Z或ZZ和跨膜結(jié)構(gòu)域組裝,構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示ZZ質(zhì)粒。將哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示ZZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞分選技術(shù),經(jīng)過數(shù)輪分選后,獲得高效展示ZZ的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。利用高效展示ZZ的細(xì)胞進(jìn)行抗體的鑒定和定量,同時(shí),運(yùn)用該細(xì)胞進(jìn)行高產(chǎn)品質(zhì)抗體的細(xì)胞克隆株的篩選和性能鑒定。這一方法簡單便捷,適用于人源、兔源和驢源等多個(gè)物種的IgG抗體。因此,本方法具有較廣泛的應(yīng)用性。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示質(zhì)粒、細(xì)胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)
抗體已經(jīng)成為醫(yī)藥市場上最暢銷的藥物,全球抗體藥物市場連續(xù)8年保持10%以上的增速,并于2021年突破2000億美元,抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)處于高速增長期。
在抗體藥物的研發(fā)過程中,穩(wěn)定的高產(chǎn)細(xì)胞株篩選和鑒定是非常關(guān)鍵的一步。在抗體的生產(chǎn)過程中,細(xì)胞株退化嚴(yán)重影響抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量,維持抗體生產(chǎn)細(xì)胞的性能和其克隆原性對抗體的質(zhì)量和品質(zhì)十分重要。高產(chǎn)細(xì)胞株鑒定和驗(yàn)證是抗體藥物研發(fā)和生產(chǎn)的必要工作。
高產(chǎn)單克隆細(xì)胞株性能的鑒定包括產(chǎn)量、效價(jià)、親和力、活性、抗體聚體、穩(wěn)定性和生長穩(wěn)定性等。比蝕法、蛋白定量法、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked?immunosorbentassay,ELISA)、質(zhì)譜法、高效液相色譜及表面等離子體共振等是常用的高產(chǎn)細(xì)胞株的鑒定方法。比蝕法和蛋白定量法簡單成本低,但檢測的是細(xì)胞分泌的所有蛋白,靈敏度低、專一性和準(zhǔn)確性低;ELISA法操作復(fù)雜時(shí)間長且成本較高;質(zhì)譜法、高效液相色譜法及表面等離子共振法需要大型的儀器設(shè)備,且通量和效率低。此外,以上檢測方法均在非生理反應(yīng)條件下進(jìn)行,檢測過程中抗體需要暴露于各自的緩沖液中,影響抗體的活性,無法進(jìn)行高產(chǎn)活性抗體單克隆株的篩選和鑒定。因此,開發(fā)分泌活性抗體的克隆株的篩選和鑒定方法,將有助于抗體藥物的開發(fā)。
目前已報(bào)道出多種可以結(jié)合抗體的多肽,并應(yīng)用于抗體的純化中(Gong?etal.2016;Sun?et?al.2018;Wei?et?al.2015)。來自的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A(staphylococcal?protein?A,SpA)的B結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別IgG的Fc片段,且不干擾抗體與抗原的結(jié)合。根據(jù)B結(jié)構(gòu)域合成的多肽常被稱為Z結(jié)構(gòu)域(Nord?et?al.1995;Phamet?al.2019),常被用于生物學(xué)和抗體純化研究中。細(xì)胞表面展示技術(shù)將目的蛋白表達(dá)在細(xì)胞外膜,可以在生理?xiàng)l件下研究蛋白與基配體的相互作用,已廣泛應(yīng)用于抗體工程、糖代謝工程及蛋白表達(dá)等領(lǐng)域(Chen?et?al.2012;Ying?et?al.2022)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示質(zhì)粒、細(xì)胞系,本發(fā)明將蛋白分泌信號(hào)肽(Serum?albumin?preproprotein,human?Igκchain等)、抗體Fc片段結(jié)合肽Z或ZZ和跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane,TM;包括PDGFR和B7.1等)組裝,構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示ZZ質(zhì)粒。將哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示ZZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞分選技術(shù),經(jīng)過數(shù)輪分選后,獲得高效展示ZZ的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測方法及應(yīng)用,采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗體對高效展示ZZ的穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行檢測,建立抗體濃度-熒光的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并擬合標(biāo)準(zhǔn)方程,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程,對未知濃度抗體進(jìn)行定量檢測。收獲抗體分泌細(xì)胞克隆的培養(yǎng)基,直接標(biāo)記高效展示ZZ的穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,再運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對抗體標(biāo)記上的陽性細(xì)胞進(jìn)行檢測,以陽性細(xì)胞的占比為標(biāo)準(zhǔn),篩選高效分泌高活性抗體的細(xì)胞克隆,實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測。
本發(fā)明還提供了以上高產(chǎn)抗體細(xì)胞株的檢測方法用于制備抗體藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
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