[發(fā)明專利]哺乳動物細胞表面展示質(zhì)粒、細胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細胞株的檢測方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310204624.4
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116286977A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鮑凌志;潘家潔;楊愛珍;馬潔;趙國平;陳少鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 皖南醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;G01N33/68;G01N33/569;G01N15/14;C12N15/10;G01N21/64;C07K16/24;C12R1/91
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34107
• 代理人: 任晨晨

本發(fā)明提供了哺乳動物細胞表面展示質(zhì)粒、細胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細胞株的檢測方法及應(yīng)用，本發(fā)明將蛋白分泌信號肽、抗體Fc片段結(jié)合肽Z或ZZ和跨膜結(jié)構(gòu)域組裝，構(gòu)建哺乳動物細胞表面展示ZZ質(zhì)粒。將哺乳動物細胞表面展示ZZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞，運用熒光標記技術(shù)和流式細胞分選技術(shù)，經(jīng)過數(shù)輪分選后，獲得高效展示ZZ的穩(wěn)定哺乳動物細胞系統(tǒng)。利用高效展示ZZ的細胞進行抗體的鑒定和定量，同時，運用該細胞進行高產(chǎn)品質(zhì)抗體的細胞克隆株的篩選和性能鑒定。這一方法簡單便捷，適用于人源、兔源和驢源等多個物種的IgG抗體。因此，本方法具有較廣泛的應(yīng)用性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及哺乳動物細胞表面展示質(zhì)粒、細胞系及抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細胞株的檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗體已經(jīng)成為醫(yī)藥市場上最暢銷的藥物，全球抗體藥物市場連續(xù)8年保持10％以上的增速，并于2021年突破2000億美元，抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)處于高速增長期。

在抗體藥物的研發(fā)過程中，穩(wěn)定的高產(chǎn)細胞株篩選和鑒定是非常關(guān)鍵的一步。在抗體的生產(chǎn)過程中，細胞株退化嚴重影響抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量，維持抗體生產(chǎn)細胞的性能和其克隆原性對抗體的質(zhì)量和品質(zhì)十分重要。高產(chǎn)細胞株鑒定和驗證是抗體藥物研發(fā)和生產(chǎn)的必要工作。

高產(chǎn)單克隆細胞株性能的鑒定包括產(chǎn)量、效價、親和力、活性、抗體聚體、穩(wěn)定性和生長穩(wěn)定性等。比蝕法、蛋白定量法、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked?immunosorbentassay，ELISA)、質(zhì)譜法、高效液相色譜及表面等離子體共振等是常用的高產(chǎn)細胞株的鑒定方法。比蝕法和蛋白定量法簡單成本低，但檢測的是細胞分泌的所有蛋白，靈敏度低、專一性和準確性低；ELISA法操作復(fù)雜時間長且成本較高；質(zhì)譜法、高效液相色譜法及表面等離子共振法需要大型的儀器設(shè)備，且通量和效率低。此外，以上檢測方法均在非生理反應(yīng)條件下進行，檢測過程中抗體需要暴露于各自的緩沖液中，影響抗體的活性，無法進行高產(chǎn)活性抗體單克隆株的篩選和鑒定。因此，開發(fā)分泌活性抗體的克隆株的篩選和鑒定方法，將有助于抗體藥物的開發(fā)。

目前已報道出多種可以結(jié)合抗體的多肽，并應(yīng)用于抗體的純化中(Gong?etal.2016；Sun?et?al.2018；Wei?et?al.2015)。來自的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A(staphylococcal?protein?A,SpA)的B結(jié)構(gòu)域可以識別IgG的Fc片段，且不干擾抗體與抗原的結(jié)合。根據(jù)B結(jié)構(gòu)域合成的多肽常被稱為Z結(jié)構(gòu)域(Nord?et?al.1995；Phamet?al.2019)，常被用于生物學(xué)和抗體純化研究中。細胞表面展示技術(shù)將目的蛋白表達在細胞外膜，可以在生理條件下研究蛋白與基配體的相互作用，已廣泛應(yīng)用于抗體工程、糖代謝工程及蛋白表達等領(lǐng)域(Chen?et?al.2012；Ying?et?al.2022)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供哺乳動物細胞表面展示質(zhì)粒、細胞系，本發(fā)明將蛋白分泌信號肽(Serum?albumin?preproprotein，human?Igκchain等)、抗體Fc片段結(jié)合肽Z或ZZ和跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane,TM；包括PDGFR和B7.1等)組裝，構(gòu)建哺乳動物細胞表面展示ZZ質(zhì)粒。將哺乳動物細胞表面展示ZZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞，運用熒光標記技術(shù)和流式細胞分選技術(shù)，經(jīng)過數(shù)輪分選后，獲得高效展示ZZ的穩(wěn)定哺乳動物細胞系統(tǒng)。

本發(fā)明還提供了抗體檢測方法、高產(chǎn)抗體細胞株的檢測方法及應(yīng)用，采用已知濃度的標準抗體對高效展示ZZ的穩(wěn)定的哺乳動物細胞進行檢測，建立抗體濃度-熒光的標準曲線，并擬合標準方程，根據(jù)標準方程，對未知濃度抗體進行定量檢測。收獲抗體分泌細胞克隆的培養(yǎng)基，直接標記高效展示ZZ的穩(wěn)定的哺乳動物細胞，再運用流式細胞術(shù)對抗體標記上的陽性細胞進行檢測，以陽性細胞的占比為標準，篩選高效分泌高活性抗體的細胞克隆，實現(xiàn)高產(chǎn)抗體細胞株的檢測。

本發(fā)明還提供了以上高產(chǎn)抗體細胞株的檢測方法用于制備抗體藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：