[發(fā)明專(zhuān)利]一種米曲霉工程菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310179700.0
• 申請(qǐng)日: 2023-02-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116262903A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李振皓;彭爽;李明焱;王瑛;李振宇;徐靖;劉成偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司;金華壽仙谷藥業(yè)有限公司;浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/15
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/15;C12N15/53;C12N15/61;C12N15/80;C12N15/64;C12P33/00;C12R1/69
• 代理公司: 杭州杭誠(chéng)專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 李博

本發(fā)明涉及羊毛甾醇的制備技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌體內(nèi)攜有表達(dá)質(zhì)粒pRA?HMGR?GLLS，其中：HMGR為3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；GLLS為羊毛甾醇合酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明的米曲霉工程菌株可以大米為底物發(fā)酵，生產(chǎn)羊毛甾醇，羊毛甾醇產(chǎn)量超過(guò)189?mg/1Kg大米，培養(yǎng)周期短、分離純化簡(jiǎn)單易行，非常適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，可為含有羊毛甾醇骨架結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物以及相關(guān)醫(yī)藥中間體的合成提供充足的原料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及羊毛甾醇的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用大米生產(chǎn)羊毛甾醇的米曲霉工程菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

羊毛甾醇屬于四環(huán)三萜類(lèi)化合物，在預(yù)防和治療白內(nèi)障方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是一種新型的白內(nèi)障預(yù)防和治療策略。同時(shí)，它還是靈芝酸、麥角甾醇及具有多種生物活性三萜類(lèi)化合物的前體。因此，羊毛甾醇在臨床藥物開(kāi)發(fā)和三萜類(lèi)天然化合物生物合成機(jī)制過(guò)程的研究中，具有十分重要的地位和作用。

目前，市售的高純度羊毛甾醇(97％以上)售價(jià)高達(dá)10～20萬(wàn)元/g，高昂的價(jià)格阻礙了羊毛甾醇的相關(guān)研究及應(yīng)用?，F(xiàn)有羊毛甾醇多為以鏈狀的角鯊烯為原料通過(guò)化學(xué)合成方法的制備，存在純度低、收率低及合成工藝復(fù)雜的問(wèn)題。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)202210527268.5，專(zhuān)利名稱(chēng)“代謝工程方法、產(chǎn)羊毛甾醇工程菌及其構(gòu)建方法、應(yīng)用”，公開(kāi)了將釀酒酵母改造為生產(chǎn)羊毛甾醇工程菌株，將其接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)制備羊毛甾醇的技術(shù)方案。但是，該技術(shù)方案中所用發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母缺陷型SD-URA-MET-LEU培養(yǎng)基，可能面臨培養(yǎng)基來(lái)源窄、羊毛甾醇產(chǎn)量不高等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)商業(yè)化羊毛甾醇售價(jià)高，而傳統(tǒng)制備方法存在收率低等問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種可用大米生產(chǎn)羊毛甾醇的米曲霉工程菌，可以大米為底物高效發(fā)酵制備羊毛甾醇，羊毛甾醇產(chǎn)量可以達(dá)到189mg/1kg大米。

本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

一種米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌體內(nèi)攜有表達(dá)質(zhì)粒pRA-HMGR-GLLS，其中：HMGR為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；GLLS為羊毛甾醇合酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明以米曲霉為出發(fā)菌株構(gòu)建米曲霉工程菌，米曲霉具有高效分解淀粉的能力，所用的表達(dá)質(zhì)粒pRA-HMGR-GLLS上攜帶pAmyB淀粉酶啟動(dòng)子，以大米為培養(yǎng)基時(shí)可以高效驅(qū)動(dòng)羊毛甾醇合酶編碼基因GLLS的高效表達(dá)。

上述米曲霉工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)表達(dá)質(zhì)粒pRA-HMGR-GLLS的構(gòu)建；

(1-1)以燕麥的cDNA為模板，以P1F為正向引物、P1R為反向引物，核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示，擴(kuò)增獲得3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因HMGR的片段；

(1-2)以pRA質(zhì)粒經(jīng)NheI酶切線(xiàn)性化處理的片段為載體，將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因HMGR的片段插入到pRA質(zhì)粒中，獲得表達(dá)質(zhì)粒pRA-HMGR；

(1-3)以靈芝的cDNA為模板，以P2F為正向引物、P2R為反向引物，核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示，擴(kuò)增獲得羊毛甾醇合酶編碼基因GLLS的片段；

(1-4)以pRA-HMGR質(zhì)粒經(jīng)KpnI酶切線(xiàn)性化處理的片段為載體，將羊毛甾醇合酶編碼基因GLLS的片段插入到pRA-HMGR質(zhì)粒中，獲得表達(dá)質(zhì)粒pRA-HMGR-GLLS；

(2)制備米曲霉工程菌株(A.oryzae/pRA-HMGR-GLLS)；