[發明專利]一種米曲霉工程菌、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202310179700.0
• 申請日: 2023-02-16
• 公開（公告）號: CN116262903A
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 李振皓;彭爽;李明焱;王瑛;李振宇;徐靖;劉成偉
• 申請（專利權）人: 浙江壽仙谷醫藥股份有限公司;金華壽仙谷藥業有限公司;浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/53;C12N15/61;C12N15/80;C12N15/64;C12P33/00;C12R1/69
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 李博

1.一種米曲霉工程菌，其特征在于，所述米曲霉工程菌體內攜有表達質粒pRA-HMGR-GLLS，其中：

HMGR為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；GLLS為羊毛甾醇合酶編碼基因片段，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.如權利要求1所述的米曲霉工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）表達質粒pRA-HMGR-GLLS的構建；

（1-1）以燕麥的cDNA為模板，以P1F為正向引物、P1R為反向引物，核苷酸序列分別如SEQID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示，擴增獲得3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因HMGR的片段；

（1-2）以pRA質粒經NheI酶切線性化處理的片段為載體，將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼基因HMGR的片段插入到pRA質粒中，獲得表達質粒pRA-HMGR；

（1-3）以靈芝的cDNA為模板，以P2F為正向引物、P2R為反向引物，核苷酸序列分別如SEQID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示，擴增獲得羊毛甾醇合酶編碼基因GLLS的片段；

（1-4）以pRA-HMGR質粒經KpnI酶切線性化處理的片段為載體，將羊毛甾醇合酶編碼基因GLLS的片段插入到pRA-HMGR質粒中，獲得表達質粒pRA-HMGR-GLLS；

（2）制備米曲霉工程菌株；

（2-1）取米曲霉的孢子保存液接入DPY培養基中，振蕩培養2~3天，獲得米曲霉菌絲體；然后加入細胞壁溶解液，振蕩2~3小時，獲得原生質體；

（2-2）向原生質體內加入緩沖液II和緩沖液III，再加入表達質粒pRA-HMGR-GLLS，混勻后冰浴10~20?min，向混合體系加入緩沖液III，室溫孵育10~20?min，然后加入緩沖液II，混勻后離心10~20?min，除去上清液后加入緩沖液II，混勻后轉移到改良的察氏培養基平板上，然后加入覆蓋培養基，倒置培養3~7天；

（2-3）待含有pRA-HMGR-GLLS轉化子長出菌絲后，利用PCR方法對其驗證，對獲得的陽性轉化子進行至少2次繼代培養后，獲得攜有表達質粒pRA-HMGR-GLLS的米曲霉工程菌。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，

步驟（1-2）中，將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼的基因HMGR片段及經NheI酶切線性化處理的pRA質粒片段按照（1～2）：2的摩爾比混合，利用單片段連接試劑盒進行連接，連接完成后將連接體系轉化到大腸桿菌DH5α，過夜培養后獲得陽性克隆子，最后經過PCR驗證和酶切驗證后，獲得表達質粒pRA-HMGR；

步驟（1-4）中，將羊毛甾醇合酶編碼的基因GLLS片段及經KpnI酶切線性化處理的pRA-HMGR質粒片段按照（1~2）：2的摩爾比混合，利用單片段連接試劑盒進行連接，連接完成后將連接體系轉化到大腸桿菌DH5α，過夜培養后獲得陽性克隆子，最后經過PCR驗證和酶切驗證后，獲得表達質粒pRA-HMGR-GLLS。