[發明專利]毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選與鑒定方法

在審

• 申請號: 202310177794.8
• 申請日: 2023-02-28
• 公開（公告）號: CN116338206A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 劉立恒;陳煒毅;萬根;鄧科;王義華;許志洋;梁海平;龔海偉
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/447
• 代理公司: 廣東東莞市中晶知識產權代理事務所(普通合伙) 44661
• 代理人: 張海英

本發明公開了一種毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，包括以下步驟：S1.雙向電泳；S2.蛋白質免疫印跡實驗。本發明以毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白為研究對象，采用免疫蛋白組學方法，系統篩選其中能夠被多種艾美耳球蟲高免雞血清所共同識別的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白；篩選出的共同免疫原性蛋白經蛋白質譜鑒定和MASCOT在線工具檢索得到相應蛋白信息，為進一步研發具有交叉保護性的雞毒害艾美耳球蟲疫苗奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及免疫蛋白組學技術領域，尤其涉及毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選與鑒定方法。

背景技術

雞球蟲病是一種對養雞行業危害極大的腸道寄生蟲病，每年能在全球造成數十億美元的經濟損失。

目前全世界雞的球蟲種類有9種，在我國發現的有柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲共7種，其中以柔嫩、毒害、巨型、堆型四種艾美耳球蟲造成的危害最大。雞感染球蟲后通常會導致腸道出血、飼料轉化率降低、體重下降等現象，嚴重的還會導致死亡。

雞球蟲對不同生長階段的雞均有感染力，但對雛雞的危害最大，能導致雛雞的大量死亡，因此，如何能夠有效地防治雞球蟲病在養殖行業成為了一個棘手的問題。目前雞球蟲病防控仍以添加化學藥物為主，但不可避免會導致耐藥性的產生和藥物殘留的危害，并且越來越多的消費者擔心食物中藥物殘留的風險。

使用弱毒活疫苗進行免疫可以有效地控制雞球蟲病，但是由于球蟲不能在宿主體外進行繁殖，加上弱毒活疫苗的生產成本高并且有毒力返強的風險，上述不足之處在很大程度上限制了弱毒活疫苗的使用。因此，研發雞球蟲基因工程亞單位疫苗成為當前雞球蟲疫苗研發的重要方向。然而，雞所生存與活動的環境中往往會同時存在多種不同類型的雞球蟲，進而對雞造成混合感染，抗單一種類球蟲的基因工程亞單位疫苗難以滿足養殖戶需求，因此，研發具有交叉免疫保護力的雞球蟲疫苗更是有著極為重要的前景。

發明內容

針對上述不足，本發明的目的在于提供毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白篩選方法，以毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白為研究對象，采用免疫蛋白組學方法，系統篩選其中能夠被多種艾美耳球蟲高免雞血清所共同識別的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白；篩選出的共同免疫原性蛋白經蛋白質譜鑒定，并經MASCOT在線工具檢索得到相應蛋白信息。

本發明為達到上述目的所采用的技術方案是：一種毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，包括以下步驟：

S1.雙向電泳：將毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白通過等電聚焦進行第一向分離，再通過凝膠電泳進行第二向分離，使得毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白依次按等電點和分子量進行分離，實現毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白的雙向分離，獲得蛋白分離凝膠；

S2.蛋白質免疫印跡實驗：將經步驟S1分離后的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白分別與四種雞艾美耳球蟲的高免雞血清進行蛋白免疫印跡實驗，篩選出能夠分別被四種高免雞血清識別的共同免疫原性蛋白。

作為本發明的進一步改進，所述雙向電泳包括以下步驟：

1)第一向等電聚焦：先將制備好的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白沉淀溶解在IPG樣本緩沖液中；在室溫下，先孵育至少1h，再以15000rpm離心15min，以除去不溶解的物質，獲得蛋白質緩沖液；取450μL含有200μg蛋白質緩沖液加載到長度為24cm的pH值為3-10的IPG預制膠條上，然后，使用再水合緩沖液在20℃下水化12h后，在電泳儀EttanIgphorII中，按以下四步進行第一向等電聚焦電泳：

①0-50V，12h；

②50-8000V，4h；

③8000-10000V，4h；