[發明專利]毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選與鑒定方法

在審

• 申請號: 202310177794.8
• 申請日: 2023-02-28
• 公開（公告）號: CN116338206A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 劉立恒;陳煒毅;萬根;鄧科;王義華;許志洋;梁海平;龔海偉
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/447
• 代理公司: 廣東東莞市中晶知識產權代理事務所(普通合伙) 44661
• 代理人: 張海英

1.毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.雙向電泳：將毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白通過等電聚焦進行第一向分離，再通過凝膠電泳進行第二向分離，使得毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白依次按等電點和分子量進行分離，實現毒害艾美耳球蟲子孢子中可溶性蛋白的雙向分離，獲得蛋白分離凝膠；

S2.蛋白質免疫印跡實驗：將經步驟S1分離后的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白分別與四種雞艾美耳球蟲的高免雞血清進行蛋白免疫印跡實驗，篩選出能夠分別被四種高免雞血清識別的共同免疫原性蛋白。

2.根據權利要求1所述的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，其特征在于，所述雙向電泳包括以下步驟：

1)第一向等電聚焦：先將制備好的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白沉淀溶解在IPG樣本緩沖液中；在室溫下，先孵育至少1h，再以15000rpm離心15min，以除去不溶解的物質，獲得蛋白質緩沖液；取450μL含有200μg蛋白質緩沖液加載到長度為24cm的pH值為3-10的IPG預制膠條上，然后，使用再水合緩沖液在20℃下水化12h后，在電泳儀EttanIgphorII中，按以下四步進行第一向等電聚焦電泳：

①0-50V，12h；

②50-8000V，4h；

③8000-10000V，4h；

④10000V，4h；

2)第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳：室溫下，將完成第一向等電聚焦處理的IPG膠條先在平衡緩沖液Ⅰ中平衡處理后，再在平衡緩沖液II中進行平衡處理，然后將IPG膠條和SDS-PAGE分子量標準品加載到12.5％w/v的SDS-PAGE凝膠上，并使用EttanDALT?12系統進行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得蛋白分離凝膠。

3.根據權利要求2所述的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，其特征在于，所述IPG樣本緩沖液包括下述組份：8mol/Lurea、2％w/v?CHAPS、50mmol/LDTT、0.2％v/vBio-Lyte3-10?ampholytes、及0.001％w/v?bromophenol?blue；所述平衡緩沖液Ⅰ包括下述組份：375mmol/LTris-HCl、6mol/Lurea、2％w/v?SDS、30％v/v甘油、及1％w/vDTT，其用量為10mL，平衡時間為15min；所述平衡緩沖液II包括下述組分：375mmol/LTris-HCl、6mol/Lurea、2.5％w/viodoracetamide、及2％w/v?SDS，其用量為6mL，平衡時間為15min；所述50mmol/LTris-HCl的pH為8.8。

4.根據權利要求1所述的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的篩選方法，其特征在于，所述蛋白質免疫印跡實驗包括以下步驟：

①轉膜：將經步驟S1分離獲得的毒害艾美耳球蟲子孢子可溶性蛋白分離凝膠上轉移到含轉膜緩沖液的PVDF膜上，使用半干轉印儀進行轉印，轉印時間為2h，電流/面積為0.70mA/cm²；

②封閉：轉膜后，將PVDF在室溫下轉移至含5％w/v脫脂牛奶、及0.05％v/vTween-20的PBST中封閉2h，然后，用PBST對PVDF洗滌3次，每次10min，其中，封閉所用的PBST的pH為7.4；

③一抗孵育：將高免雞血清與PBS按體積比1:100進行稀釋后均勻加至PVDF膜上，在室溫下孵育1h，然后用PBST洗滌3次，每次10min；

④二抗孵育：將HRP標記的山羊抗雞IgG與PBS按體積比為1:2000的比例稀釋后加至PVDF膜上，在室溫下孵育1h，然后用PBST洗滌3次，每次10min，將膜徹底清洗；

⑤ECL顯影：將ECL顯影液A液與B液等體積加入避光的EP管中，混合均勻；在遮光環境中，把二抗后的PVDF膜放入曝光機中，將制備好的ECL混合液均勻滴加至PVDF膜上，并且適當地正反面翻轉PVDF膜，使其與ECL混合液均勻接觸，并且將空氣排盡，防止氣泡的產生；調設好設備參數，進行曝光，觀察曝光結果，使用Bio-rad凝膠成像系統拍照，獲得蛋白質斑點圖。