[發明專利]一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌及其構建方法

在審

• 申請號: 202310174396.0
• 申請日: 2023-02-28
• 公開（公告）號: CN116396876A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 林源;楊生超;張廣輝;郝冰;盧迎春;王益娜
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/56;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/53;C12P33/20;C12R1/865
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

本發明涉及一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌及其構建方法，屬于分子生物學和生物工程技術領域。所述的生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌是在產原人參二醇的起始菌株ZW04BY釀酒酵母中敲除β?葡萄糖苷酶EGH1，過表達葡萄糖磷酸變位酶1、葡萄糖磷酸變位酶2和UDP?葡萄糖焦磷酸化酶，糖基轉移酶Pn1?31、糖基轉移酶PnUGT53、糖基轉移酶PnUGT50和原人參二醇合成酶PPDS。本發明獲得的釀酒酵母工程菌能夠利用葡萄糖發酵生產人參皂苷Rd，產量為56.68±16.21mg/L；酵母生長繁殖較快，僅需發酵罐就可以生產，為人工細胞高效合成人參皂苷Rd奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物工程技術領域，涉及異源合成人參皂苷Rd的重組釀酒工程菌及其構建方法，具體涉及一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌及其構建方法。

背景技術

人參皂苷Rd具有保護心血管系統、保護神經系統、抗衰老、抗腫瘤、免疫調節、鎮痛等多種藥理活性，藥用價值較高。人參皂苷Rd可用于腫瘤、心血管系統、腎臟衰竭及炎癥等疾病治療。目前人參皂苷Rd已經成為治療腦卒中的國家一類候選新藥，其作為新型神經保護劑的臨床應用具有良好的發展前景。人參皂苷Rd的分子式如式(Ⅰ)所示。

人參皂苷Rd主要的獲取方式主要是從人參屬植物中提取，但人參皂苷Rd在人參屬植物中的含量都比較低，而人參屬植物種植存在栽培周期長、連作障礙、農藥及重金屬殘留等問題，有限的天然資源及人工栽培技術極大的限制了人參皂苷Rd的推廣和應用。另外，化學合成因使用昂貴的起始原料和繁瑣的合成程序而黯然失色。因此，利用合成生物學技術改造微生物生產人參皂苷Rd提供了一種最有潛力的替代方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌及其構建方法。通過ZW04BY釀酒酵母工程菌中異源表達人參皂苷Rd通路合成的3個關鍵糖基轉移酶實現了人參皂苷Rd在釀酒酵母中的從頭生產，其合成途徑如圖1所示，并且此工程菌人參皂苷Rd產量較高。本發明的方法為人工細胞高效合成人參皂苷Rd奠定了基礎。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌，在產原人參二醇的起始菌株ZW04BY釀酒酵母中敲除β-葡萄糖苷酶EGH1，過表達葡萄糖磷酸變位酶1、葡萄糖磷酸變位酶2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，糖基轉移酶Pn1-31、糖基轉移酶PnUGT53、糖基轉移酶PnUGT50和原人參二醇合成酶PPDS；所述糖基轉移酶PnUGT50的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述葡萄糖磷酸變位酶1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述葡萄糖磷酸變位酶2的核苷酸序列如SEQID?NO.3所示；所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶如SEQ?ID?NO.4所示；所述糖基轉移酶Pn1-31的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述優化后的糖基轉移酶PnUGT53的核苷酸序列如SEQ?IDNO.6所示；原人參二醇合成酶PPDS的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

進一步，優選的是，所述釀酒酵母基因組中整合過表達原人參二醇至人參皂苷Rd途徑中的所有基因，包括原人參二醇合成酶PPDS、糖基轉移酶PnUGT50和糖基轉移酶PnUGT53。

本發明還提供上述生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌的構建方法，包括以下步驟：

(1)通過在產原人參二醇的起始菌株ZW04BY釀酒酵母中敲除β-葡萄糖苷酶EGH1，通過PCR擴增，將葡萄糖磷酸變位酶1、葡萄糖磷酸變位酶2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖基轉移酶Pn1-31和糖基轉移酶PnUGT53導入起始菌株ZW04BY，獲得重組菌株1；

(2)在重組菌株1的基礎上，分別在組合型啟動子TDH3+UAS_{TEF1-CIT1-CLB2}和ADH1啟動子的控制之下，過表達密碼子優化后的糖基轉移酶PnUGT50和糖基轉移酶PnUGT53，獲得重組菌株2；