[發明專利]一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌及其構建方法

在審

• 申請號: 202310174396.0
• 申請日: 2023-02-28
• 公開（公告）號: CN116396876A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 林源;楊生超;張廣輝;郝冰;盧迎春;王益娜
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/56;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/53;C12P33/20;C12R1/865
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.一種生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌，其特征在于，在產原人參二醇的起始菌株ZW04BY釀酒酵母中敲除β-葡萄糖苷酶EG?H?1，過表達葡萄糖磷酸變位酶1、葡萄糖磷酸變位酶2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，糖基轉移酶Pn?1-31、糖基轉移酶PnUGT53、糖基轉移酶PnUGT50和原人參二醇合成酶PPDS；所述糖基轉移酶PnUGT50的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述葡萄糖磷酸變位酶1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述葡萄糖磷酸變位酶2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶如SEQ?ID?NO.4所示；所述糖基轉移酶Pn?1-31的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述優化后的糖基轉移酶PnUGT53的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；原人參二醇合成酶PPDS的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

2.根據權利要求1所述的生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母基因組中整合過表達原人參二醇至人參皂苷Rd途徑中的所有基因，包括原人參二醇合成酶PPDS、糖基轉移酶PnUGT50和糖基轉移酶Pn?UGT53。

3.權利要求1所述的生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)通過在產原人參二醇的起始菌株ZW04BY釀酒酵母中敲除β-葡萄糖苷酶EG?H?1，通過PCR擴增，將葡萄糖磷酸變位酶1、葡萄糖磷酸變位酶2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖基轉移酶Pn?1-31和糖基轉移酶PnUGT53導入起始菌株ZW04BY，獲得重組菌株1；

(2)在重組菌株1的基礎上，分別在組合型啟動子TDH3+UAS_{TEF1-CIT1-CLB2}和ADH?1啟動子的控制之下，過表達密碼子優化后的糖基轉移酶PnUGT50和糖基轉移酶PnUGT53，獲得重組菌株2；

(3)將來自人參的原人參二醇合成酶基因PPDS進行酵母密碼子優化，串聯組合型啟動子TDH3+UAS_{TEF1-CIT1-CLB2}和G418抗性篩選標簽，一起導入起始釀酒酵母重組菌株2的δ序列位點，獲得重組菌株3；

(4)獲得的重組菌株3在搖瓶條件下進行發酵測產，獲得的生產人參皂苷Rd的釀酒酵母工程菌。