[發明專利]mRNA的制備方法

在審

• 申請號: 202310136404.2
• 申請日: 2023-02-20
• 公開（公告）號: CN116286793A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 張海峰;陳慧;劉欣;宋恒遠;馬宏丹;張勁松;代亞東;張勝
• 申請（專利權）人: 蘇州博騰生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 蘇婕

本發明通過在DNA轉錄模板的啟動子和目的基因之間設計限制性酶切位點，于體外轉錄體系中進行第一階段轉錄反應，轉錄過程產物產量無明顯產量上升后，加入對應的限制性內切酶進行第二階段轉錄反應，切斷所述線性DNA轉錄模板的啟動子片段，使RNA聚合酶無法識別線性DNA轉錄模板，因此RNA聚合酶無法與線性DNA轉錄模板結合，即不再啟動新的轉錄，大部分的未轉錄完成的mRNA序列片段繼續延伸完成轉錄，可轉錄成完整的mRNA，提高了mRNA的序列完整性。

技術領域

本發明涉及mRNA分子技術領域，特別是涉及mRNA的制備方法。

背景技術

隨著核酸技術的發展，基因治療越來越成為醫藥行業的熱點，作為一種重要的基因療法，核酸藥物越來越受到市場的青睞。近年來，核酸藥物已成為全球研發和投資的重點領域。相較于在蛋白層面進行疾病干預的傳統藥物，核酸藥物能被遞送到細胞內產生各種蛋白，包括可溶性蛋白、膜蛋白和細胞內蛋白，尤其是可以產生傳統制藥方法獲得的蛋白，與DNA基因治療相比，mRNA是一種瞬時表達工具，具有更好的生物安全性和成藥性。mRNA藥物在遺傳信息傳遞源頭發揮作用，因此具有特異性強、基因靶點豐富、療效持久等優勢，且避免傳統藥物復雜的合成與純化流程，并能顯著降低生產成本。隨著mRNA的生產技術的發展和完善，人們已經可以在體外大量合成mRNA藥物分子，并已應用于上市的mRNA新冠疫苗的生產，這給基于mRNA的基因藥物帶來了巨大的機遇。

目前常見的mRNA的合成方法為體外逆轉錄法，體外合成RNA(IVT)主要是以DNA為模板通過體外轉錄得到，常用的是以線性化質粒DNA或PCR擴增產物為模板利用RNA聚合酶在體外轉錄合成。主要過程是利用含有T7啟動子(TAATACGACTCACTATAGGG)或SP6啟動子(ATTTAGGTGACACTATAG)序列的DNA為模板在含有T7或SP6?RNA聚合酶的條件下，以NTP為底物合成與模板DNA中一條鏈互補的mRNA，簡單快速獲得大量的mRNA分子，通過在5’端加上帽子結構和3’端加ployA尾加強mRNA的穩定性。

現有的IVT轉錄工藝，通過序列合成和構建環狀質粒，用限制性內切酶將環狀質粒酶切成線性化質粒模板，將線性化質粒純化后，進行IVT轉錄反應，轉錄過程是啟動子和RNA聚合酶的隨機的不停歇的啟動和轉錄過程，最后的反應階段存在大量未轉錄完成的mRNA序列片段，在加入DNaseⅠ消化模板終止反應的時候，大量未轉錄完成的mRNA序列片段被同時終止，使轉錄生產的mRNA中存在各種不同長度的mRNA序列片段，這些未轉錄完成的mRNA序列片段屬于雜質，根據mRNA序列片段的特性，有形成dsRNA或被目標mRNA裹挾形成聚體的可能性。隨著科研和市場的發展，傳統的合成方法已經逐漸不能滿足科研試驗和藥物研發對mRNA的需求，越來越多的mRNA生物研究和藥物研發中對RNA產品的完整性也提出了更高的要求。

發明內容

基于此，有必要提供一種提高mRNA的完整性的mRNA的制備方法。

本申請的一個方面，提供了一種mRNA的制備方法。包括如下制備步驟：

提供線性DNA轉錄模板；所述線性DNA轉錄模板包括正義鏈和反義鏈；所述正義鏈包括啟動子和目的DNA，所述啟動子與所述目的DNA之間設有限制性酶切位點；

所述線性DNA轉錄模板于體外轉錄體系中進行第一階段轉錄，制備第一階段轉錄產物；

向所述第一階段轉錄產物中加入識別所述限制性內切酶位點的限制性內切酶X，進行第二階段轉錄，制備所述mRNA。

在其中一些實施例中，所述限制性內切酶X選自為SpeⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ中的一種。

在其中一些實施例中，第二階段轉錄的時間為15min～120min。

在其中一些實施例中，所述體外轉錄體系包括IVT轉錄體系。

在其中一些實施例中，第一階段轉錄的時間為15min～120min。