[發明專利]一種牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202310129089.0
• 申請日: 2023-02-17
• 公開（公告）號: CN116333921A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 李劼;高潔;劉文香;李化生;張立華;張慧;穆楊
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K39/102;A61K35/74;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 魏志恒

本發明公開了一種牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡，涉及疫苗制備技術領域，所述外膜囊泡為夾膜B群牛多殺性巴氏桿菌CVCC44502株分泌。本發明首次將多殺性巴氏桿菌外膜囊泡作為疫苗免疫動物，通過動物試驗證明本發明多殺性巴氏桿菌外膜囊泡具有顯著預防多殺性巴氏桿菌病的效果，可用于制備預防多殺性巴氏桿菌病的產品，從而應用于預防多殺性巴氏桿菌病、避免細菌耐藥性，具備良好的實際應用價值。

技術領域

本發明涉及疫苗制備技術領域，更具體的說是涉及一種牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡及其制備方法與應用。

背景技術

外膜囊泡(OMVs)是革蘭氏陰性菌表面分泌的產物，是細菌外膜在一定的機制下發生出芽并在細菌表面形成一種囊泡狀的結構，這種結構包括了外膜以及周質成分。外膜囊泡大多數為球形，直徑大約在20–250nm之間。1959年，De等首次發現霍亂弧菌濾除細菌后的培養液能夠誘導家兔對霍亂弧菌的免疫反應。Chatterje等在研究對數生長期霍亂弧菌的超微結構時，發現在液體培養基無菌濾液中有革蘭氏陰性菌細胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易發生囊泡出芽的位點附近，顆粒物質含量較高，這些顆粒可以隨著細胞質進入出芽的囊泡中。OMVs的產生代表著細菌具有向外部環境釋放大量的，復雜的蛋白組分和磷脂的獨特機制。后來的研究發現，幾乎所有的革蘭氏陰性菌都能產生OMVs，其化學結構的組成成分除了外膜蛋白還有其他一些膜結構成分，所以人們將這種膜結構的囊泡稱為外膜囊泡。

隨著公共衛生的進步，細菌感染發生有所降低，但細菌感染仍然是導致人類生病和死亡的主要原因之一。由于耐藥菌的增加和快速傳播，抗生素治療細菌性疾病的有效性受到了挑戰。因此，疫苗被認為是后抗生素時代應對細菌性疾病最直接有效的策略。高效的疫苗必然具備三大因素，(1)抗原：能夠觸發免疫反應，產生免疫記防止機體受到進一步的攻擊。(2)佐劑：保證免疫反應足夠強大。(3)具一定的安全性。

OMVs中包含的外膜組分可以刺激機體產生適應性免疫記憶，含有的LPS可作為自身佐劑，而且作為非復制性疫苗具一定安全性。所以這些因素促使OMVs成為開發非復制性高效疫苗的熱門選擇。

現有多殺性巴氏桿菌疫苗種類包括牛Pm滅活疫苗、牛Pm弱毒活疫苗、牛Pm亞單位疫苗。但滅活疫苗接種后不能在動物體內繁殖，因此使用時接種劑量較大，接種次數較多，免疫期較短，通常需要加入適當的佐劑以增強免疫效果。弱毒活疫苗運輸和存儲不方便，并且存在可能毒力返強的現象。亞單位疫苗免疫原性較低，需與佐劑合用才能產生好的免疫效果。

多殺性巴氏桿菌病的預防與診療是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡及其制備方法與應用，本發明疫苗的產出旨在增強免疫效果，產生良好的交叉免疫性，提高動物保護率，避免細菌耐藥性造成的細菌病難以控制的現狀實現對牛多殺性巴氏桿菌病的有效預防。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡，所述外膜囊泡為夾膜B群牛多殺性巴氏桿菌CVCC44502株分泌。

作為優選的技術方案，所述外膜囊泡具有雙層膜結構的囊泡狀小體，攜帶細菌外膜和周質成分，包括酶、毒力因子、細菌特異性抗原和多種病原相關分子模式。

作為優選的技術方案，所述外膜囊泡粒徑在200nm以內，蛋白條帶大小集中在33KDa-45?KDa之間。

本發明的另一目的是，提供上述牛多殺性巴氏桿菌外膜囊泡的制備方法，包括以下步驟：

(1)將莢膜B群牛多殺性巴氏桿菌CVCC?44502株培養到穩定期，得到菌液；

(2)將菌液10000rpm/min，4℃，離心10min，取上清過0.45μm濾膜；