[發(fā)明專利]用于體外滲透實驗的離體皮膚的保存方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310123449.6
• 申請日: 2023-02-16
• 公開（公告）號: CN115997758A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂慧俠;凌佳偉;杜雅楠;盛雨澤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

本發(fā)明涉及了皮膚凍存，具體涉及用于體外滲透實驗的離體皮膚的保存方法，其中用于體外滲透實驗的離體皮膚的低溫儲存介質(zhì)，其主要由二甲亞砜或甘油、DMEM高糖培養(yǎng)基組成，其中二甲亞砜和甘油為冷凍保護(hù)劑，它們總占比為5％?20％，DMEM高糖培養(yǎng)基占80％?95％，按體積百分?jǐn)?shù)計。本發(fā)明的低溫儲存介質(zhì)制備方法簡單，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。利用本發(fā)明的低溫儲存介質(zhì)及凍存方法保存的離體皮膚的皮膚活力高，且皮膚活力維持時間長，有利于延長體外滲透實驗用皮膚的保存時間，從而提高體外滲透實驗的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物材料低溫保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以二甲亞砜或甘油為冷凍保護(hù)劑，DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液的離體皮膚低溫儲存介質(zhì)及皮膚保存方法。

背景技術(shù)

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)是指以皮膚為給藥途徑，藥物遞送進(jìn)入人體血液循環(huán)，發(fā)揮全身治療作用。經(jīng)皮給藥作為繼口服給藥和注射給藥后的第三大給藥系統(tǒng)，其獨特的優(yōu)勢在于避免了口服給藥的胃腸道降解作用和肝臟首過效應(yīng)，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率，提高了患者用藥的順應(yīng)性。

在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的產(chǎn)品研發(fā)和科學(xué)研究過程中，制劑中藥物經(jīng)皮滲透性的評價是成功的關(guān)鍵一環(huán)。在經(jīng)皮給藥制劑開發(fā)中，常以臨床試驗結(jié)果作為制劑優(yōu)劣的評價標(biāo)準(zhǔn)，然而新藥研發(fā)、仿制藥研發(fā)過程中面臨著臨床試驗成本過高以及倫理的問題，因此體外滲透實驗因其較低的成本和較好的體內(nèi)體外相關(guān)性被廣泛用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的體外評價。體外滲透實驗主要是采用人或動物的離體皮膚及合適的分析方法，動態(tài)監(jiān)測給藥后特定時間內(nèi)透過皮膚的藥物量和滲透速率，從而考察藥物及其制劑的體外經(jīng)皮滲透行為，它是制劑處方工藝篩選和優(yōu)化過程中主要的評判標(biāo)準(zhǔn)，是仿制制劑與參比制劑的一致性評價中的主要手段。

當(dāng)前用于體外滲透實驗的離體動物皮膚常用的儲存方法是：皮膚制備完成后，用純水或生理鹽水沖洗干凈后直接冷凍于低溫或超低溫冰箱中，即-20℃和-80℃，實驗前取出解凍，使用前使用生理鹽水沖洗。而這種沒有冷凍保護(hù)的保存方法會導(dǎo)致皮膚的活力因低溫冷凍而受到嚴(yán)重破壞，因此用于體外評價時，往往已經(jīng)是“死亡”的皮膚，從而影響經(jīng)皮給藥系統(tǒng)體外滲透性評價的準(zhǔn)確性。目前為止，少有針對經(jīng)皮給藥用皮膚模型體外保存及質(zhì)量變化的系統(tǒng)研究，所以怎么篩選合適的離體皮膚保存方法是一個技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是維持用于體外滲透實驗的離體皮膚的活力和通透性。因此，本發(fā)明提供了一種以二甲亞砜或甘油為冷凍保護(hù)劑的低溫儲存介質(zhì)。

一種離體皮膚低溫儲存介質(zhì)，其特征在于：含有冷凍保護(hù)劑和DMEM高糖培養(yǎng)基。其中冷凍保護(hù)劑占5％-20％，DMEM高糖培養(yǎng)基占80％-95％。

所述冷凍保護(hù)劑為二甲亞砜、甘油中的一種或兩種。

所述低溫儲存介質(zhì)優(yōu)選的組成為10％二甲亞砜和90％DMEM高糖培養(yǎng)基。

所述低溫儲存介質(zhì)優(yōu)選的組成為10％甘油和90％DMEM高糖培養(yǎng)基。

所述低溫儲存介質(zhì)的制備方法為將冷凍保護(hù)劑和DMEM高糖培養(yǎng)基充分混合即得。

所述低溫儲存介質(zhì)的降溫程序為4℃冰箱孵育20min后，轉(zhuǎn)入-20℃冰箱凍存；或者4℃冰箱孵育20min后，轉(zhuǎn)入-20℃冰箱降溫30min，最后放入-80℃冰箱凍存。

所述低溫儲存介質(zhì)中皮膚的解凍復(fù)溫的方法為37℃恒溫水浴箱中快速解凍，待全部融化后，棄去離心管中的凍存液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基，孵育3min后棄去，重復(fù)三次，用DMEM清洗后再用生理鹽水清洗。

SD大鼠離體皮膚的制備方法，步驟如下：

取皮：取體重200-220g的SD大鼠，按5mL/kg的劑量腹腔注射20％烏來糖溶液麻醉；固定于自制紙板上，使用寵物電推剪推去大鼠腹部毛發(fā)，再使用電動剃須刀輕緩地剃去細(xì)小絨毛；脫頸致死后，使用手術(shù)剪將去除毛發(fā)的腹部皮膚剪下。