[發(fā)明專利]一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310116368.3
• 申請日: 2023-02-09
• 公開（公告）號: CN116426669A
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王立浩;于海龍;馮錫剛;曹亞從;張正海;吳華茂;李雪橋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所;海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 青島鼎丞智佳知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37277
• 代理人: 吳春艷

1.一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，其特征在于：所述分子標(biāo)記引物包括兩條前引物A1、A2和一條共用后引物C；

所述前引物A1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述前引物A2的核苷酸序列如SEQID?NO.2所示，所述后引物C的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，其特征在于：將所述前引物A1的5′端添加FAM熒光標(biāo)簽序列，將所述前引物A2的5′端添加HEX熒光標(biāo)簽序列；所述FAM熒光標(biāo)簽序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述HEX熒光標(biāo)簽序列如SEQ?IDNO.5所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的KASP分子標(biāo)記在鑒定辣椒根結(jié)線蟲抗病品種上的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的KASP分子標(biāo)記在鑒定辣椒根結(jié)線蟲抗病品種上的應(yīng)用，其特征在于：辣椒根結(jié)線蟲抗病品種的鑒定方法如下：

步驟一：檢測：采用上述引物對待測辣椒后代群體材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增和基因分型；

步驟二：結(jié)果判斷：聚合在接近X軸的顯示藍(lán)色的樣本的基因型為連接FAM熒光標(biāo)簽序列的等位基因型，A:A基因型，為抗病材料；聚合在接近Y軸上的顯示綠色的樣本的基因型為連接HEX熒光標(biāo)簽序列的等位基因型，C:C基因型，為感病材料；中間顯示紅色的樣本的基因型為兩種等位基因的雜合型，C:A基因型，為抗病材料。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的KASP分子標(biāo)記在鑒定辣椒根結(jié)線蟲抗病品種上的應(yīng)用，其特征在于：

所述KASP標(biāo)記的PCR擴增體系為4.055μL，其中DNA模板2μL，KASP?V4.0?2X?Master?mix96/384Low?Rox?2μL，引物混合液0.055μL；

所述KASP標(biāo)記的PCR擴增程序為：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的KASP分子標(biāo)記在鑒定辣椒根結(jié)線蟲抗病品種上的應(yīng)用，其特征在于：所述KASP?V4.0?2X?Master?mix?96/384Low?Rox包括熒光探針A、熒光探針B、淬滅探針A和淬滅探針B；

所述熒光探針A的序列如SEQ?ID?NO.6所示，其5′末端連接1個熒光基團(tuán)FAM；所述熒光探針B的序列如SEQ?ID?NO.7所示，其5′末端連接1個熒光基團(tuán)HEX；所述淬滅探針A的序列如SEQ?ID?NO.8所示，其3′末端連接淬滅基團(tuán)Q；所述淬滅探針B的序列如SEQ?ID?NO.9所示，其3′末端連接淬滅基團(tuán)Q。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，其特征在于：所述引物混合液體系為50μL，包含后引物C15μL，前引物A1?6μL，前引物A2?6μL和滅菌H₂O?23μL，其中引物濃度均為100μmol·L^-1。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，其特征在于：若基因分型的檢測結(jié)果不明顯，可添加程序94℃20s，57℃60s，3個循環(huán)；37℃1min，再進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種辣椒根結(jié)線蟲抗性基因Me1緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記在鑒定辣椒后代群體中根結(jié)線蟲抗病材料上的應(yīng)用，其特征在于：所述KASP?PCR擴增反應(yīng)后讀數(shù)需使用Roche?480熒光定量儀，進(jìn)行KASP?Genotying，讀取熒光數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件進(jìn)行基因分型，所述基因分型數(shù)據(jù)處理軟件為KlusterCaller軟件。