[發(fā)明專利]一種星油藤葉片細(xì)胞來(lái)源的原生質(zhì)體的制備方法與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310116234.1
• 申請(qǐng)日: 2023-02-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116004506A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陽(yáng)天泉;代歡;李飛;徐偉;李紅梅;馬俊超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12N15/82;C12N15/65
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 耿彩紅

本發(fā)明公開(kāi)了一種星油藤葉片細(xì)胞來(lái)源的原生質(zhì)體的制備方法與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化星油藤葉片酶裂解時(shí)間，裂解溫度和試劑使用濃度等條件，獲得了高效的星油藤葉片原生質(zhì)體分離方法。在此基礎(chǔ)上，摸索了星油藤原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法，成功將帶有GFP(綠色熒光蛋白)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到星油藤葉片原生質(zhì)體。該方法可以進(jìn)一步用于基因功能分析。本發(fā)明為星油藤功能基因分析建立了一種快速有效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，為后期星油藤關(guān)鍵功能基因的深入研究奠定了工作基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種星油藤葉片細(xì)胞來(lái)源的原生質(zhì)體的制備方法與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

原生質(zhì)體(protoplast)指采用機(jī)械或酶解法去掉了細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，植物原生質(zhì)體在作物遺傳改良和植物學(xué)研究中具有較大的應(yīng)用潛力。原生質(zhì)體可以用于種質(zhì)資源保存(超低溫保存)、原生質(zhì)體融合創(chuàng)制優(yōu)良新品種(細(xì)胞雜交)、篩選突變體(細(xì)胞無(wú)性系變異)、以及遺傳轉(zhuǎn)化。由于去掉了細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體容易攝入外源遺傳物質(zhì)，如果具有再生能力，容易獲得轉(zhuǎn)化植物。尤其是在新興的植物基因編輯領(lǐng)域，由于瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)，再生植物不攜帶外源片段，在作物育種中具有很大的應(yīng)用前景。此外，原生質(zhì)體是基因瞬時(shí)表達(dá)的理想材料，已廣泛用于蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子活性和蛋白質(zhì)相互作用等研究。

星油藤(PlukenetiavolubilisL.)又名印加果(SachaInchi)、印加花生(IncaPeanut)，是大戟科多年生木質(zhì)藤本植物，其種子富含油脂(約占種子干重的45-50％)，其中α-亞麻酸(ALA)含量高達(dá)總脂的50％，是一種具有重要開(kāi)發(fā)利用前景的油料植物。2006年我國(guó)開(kāi)始引種栽培星油藤，在云南南部熱帶、亞熱帶山地地區(qū)生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)良好。星油藤是極具開(kāi)發(fā)前景的特種食用油料植物，其種子如何高效累積ALA的分子機(jī)理值得深入研究。然而，關(guān)于星油藤油脂合成相關(guān)基因的功能研究相對(duì)滯后，主要難點(diǎn)在于缺乏穩(wěn)定的自身轉(zhuǎn)化體系。目前尚未見(jiàn)有星油藤再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道，而原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系將為星油藤功能基因研究提供重要技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種星油藤葉片細(xì)胞來(lái)源的原生質(zhì)體的制備方法與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的一種星油藤葉片細(xì)胞來(lái)源的原生質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟：(1)選取正常生長(zhǎng)狀況下幼嫩的星油藤真葉1-2片；黑暗條件下，用真空泵抽真空，用錫箔紙包好培養(yǎng)皿，室溫放到搖床上以最小幅度，震蕩過(guò)夜裂解；

(2)在顯微鏡下檢查原生質(zhì)體釋放情況，觀察到較多單個(gè)細(xì)胞即可停止酶裂解反應(yīng)，向原生質(zhì)體酶解液中加入等體積4℃預(yù)冷的W5溶液，所述的原生質(zhì)體酶解液與W5溶液的體積比為1：1；

(3)用W5溶液潤(rùn)濕100目篩網(wǎng)，將原生質(zhì)體酶解液過(guò)濾到50mL圓底離心管，離心機(jī)調(diào)到soft模式，22℃，100g離心5min，去除上清液，用10mlW5溶液輕柔地重懸原生質(zhì)體，冰上靜置待原生質(zhì)體自然沉降。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，植株上最新展開(kāi)且面積未超過(guò)子葉的幼嫩葉片，用刀片小心把葉片切成小于1mm細(xì)葉條，盡量去掉葉脈組織。

進(jìn)一步地，在步驟（1）中，切好的葉條完全浸入提前配置的30ml酶解液，所述的酶解液配置方法為：15g/L纖維素酶RS，?4g/L解離酶，0.4M甘露醇，20mM?MES，?20mM?KCl，10mM?CaCl₂，?1g/L?BSA，余量為去離子水，pH為5.7，所述室溫為22?℃；所述的抽真空時(shí)間為1小時(shí)，所述的最小幅度為50?rpm，震蕩過(guò)夜時(shí)間為12-16h。

更進(jìn)一步地，在步驟(2)中，獲得原生質(zhì)體后，進(jìn)行GFP綠色熒光蛋白載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，步驟如下：將上述原生質(zhì)體溶液分裝至2mlEP管，每支200ul；加入GFP載體5ul-10ul，濃度大于200ng/μL，用指尖輕柔混合；