[發明專利]一種星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法與質粒轉化方法

在審

• 申請號: 202310116234.1
• 申請日: 2023-02-15
• 公開（公告）號: CN116004506A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 陽天泉;代歡;李飛;徐偉;李紅梅;馬俊超
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;C12N15/65
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 耿彩紅

1.一種星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：（1）選取正常生長狀況下幼嫩的星油藤真葉2片；黑暗條件下，用真空泵抽真空，用錫箔紙包好培養皿，室溫放到搖床上以最小幅度，震蕩過夜裂解；

（2）在顯微鏡下檢查原生質體釋放情況，觀察到較多單個細胞即可停止酶裂解反應，向原生質體酶解液中加入等體積4?℃?預冷的W5溶液，所述的原生質體酶解液與W5溶液的體積比為1：1；

（3）用W5溶液潤濕100目篩網，將原生質體酶解液過濾到50mL圓底離心管，離心機調到soft模式，22℃，100g離心5min，去除上清液，用10ml?W5溶液輕柔地重懸原生質體，冰上靜置待原生質體自然沉降。

2.根據權利要求1所述的星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法，其特征在于：在步驟（1）中，植株上最新展開且面積未超過子葉的幼嫩葉片，用刀片小心把葉片切成小于1mm細葉條，盡量去掉葉脈組織。

3.根據權利要求1所述的星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法，其特征在于：在步驟（1）中，切好的葉條完全浸入提前配置的30ml酶解液，所述的酶解液配置方法為：15g/L纖維素酶RS，?4g/L解離酶，0.4M甘露醇，20mM?MES，?20mM?KCl，?10mM?CaCl₂，?1g/L?BSA，余量為去離子水，pH為5.7，所述室溫為22?℃；所述的抽真空時間為1小時，所述的最小幅度為50?rpm，震蕩過夜時間為12-16h。

4.根據權利要求1所述的星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法，其特征在于：在步驟（2）中，獲得原生質體后，進行GFP綠色熒光蛋白載體的瞬時轉化，步驟如下：將上述原生質體溶液分裝至2ml?EP管，每支200ul；加入GFP載體5ul-10ul，濃度大于200?ng/μL，用指尖輕柔混合；

加入等體積200ul的PEG4000溶液，PEG4000溶液的配置方法：將0.2M甘露醇、400g/LPEG4000和100mMCaCl₂，用指尖輕柔混勻，誘導轉化30min；加入400μL?W5溶液輕柔顛倒混勻以終止反應，離心機調至soft模式，100g離心2min，棄上清液，加入200μL?W5輕柔重懸沉淀，soft模式，100g離心2min，棄上清液。

5.根據權利要求1所述的星油藤葉片細胞來源的原生質體的制備方法，其特征在于：在步驟（2）中，W5溶液的配方為：9g/L?NaCl，?13.9g/L?Ca?Cl₂，?0.37g/L?KCl，?2mM?MES，?pH為5.7。

6.權利要求1所述的星油藤葉片細胞來源的原生質體的質粒轉化方法，其特征在于包括如下步驟：（1）將權利要求1制備所得的原生質體溶液分裝至2ml?EP管，每支200ul；

（2）加入GFP載體5ul-10ul，濃度大于200?ng/μL，用指尖輕柔混合；

（3）加入200ul等體積的PEG4000溶液，所述的PEG4000溶液配置方法：將0.2M甘露醇、400g/L?PEG4000和100mMCaCl₂用指尖輕柔混勻，誘導轉化30min；

（4）加入400μL?W5溶液輕柔顛倒混勻以終止反應，離心機調至soft模式，100g離心2min，棄上清液，加入200μL?W5輕柔重懸沉淀，soft模式，100g離心2min，棄上清液；

（5）用400μL?WI溶液，所述的WI溶液的配置方法：將0.3g/L?KCl，36.45g/L甘露醇和0.75g/L?MES輕柔重懸沉淀，錫紙包裹，傾斜放入28℃培養箱，弱光下過夜培養后進行熒光觀測，培養時間為12-16h。