[發明專利]評價酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法

在審

• 申請號: 202310098248.5
• 申請日: 2023-02-10
• 公開（公告）號: CN116203002A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 黃和強;陳杉彬;李善文;韓興林;王德良;馮聲寶;趙文梅
• 申請（專利權）人: 青海互助天佑德青稞酒股份有限公司;中國食品發酵工業研究院有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/02;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62
• 代理公司: 北京瀚群律師事務所 11581
• 代理人: 毛軍

1.一種評價酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、將對數生長期能夠穩定表達GFP-RFP-LC3蛋白的人肝細胞L02用胰蛋白酶消化，配制成單細胞懸液；

步驟二、在6孔板中每個孔均勻放置3個蓋玻片Micro?Cover?Glass，在6孔板孔中先加少量培養基(以使玻片與培養皿緊密接觸)，使玻片緊密貼合，按1.5×10⁴cell/mL的密度將能穩定表達GFP-RFP-LC3的LO2細胞接種于6孔板中，每孔1mL,蓋上6孔板后置于在37℃,5％CO₂條件下進行培養24h至細胞貼壁；

步驟三、移去細胞培養液，用PBS清洗2遍，之后貼壁加入2mL細胞培養混合液，其中包含80μL樣品，在37℃,5％CO₂條件下進行培養24h；

步驟四、移去上清液，用PBS清洗2遍，然后在4％多聚甲醛中固定15min；

步驟五、用PBS清洗2遍，用鑷子將玻片夾起，將玻片置于濾紙上晾干，并在載玻片上滴加含DAPI的防淬滅劑，將爬滿細胞的一面置于防淬滅劑上；

步驟六、使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述GFP-RFP-LC3蛋白的序列氨基酸序列為SEQIDNO.1。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述能夠穩定表達GFP-RFP-LC3蛋白的人肝細胞L02的制備方法包括：克隆或合成GFP、RFP、LC3基因，組裝GFP-RFP-LC3質粒；將制備的GFP-RFP-LC3質粒與pMD2G和PSApX2包裝質粒共轉染至293T細胞，制備攜帶有GFP-RFP-LC3基因的慢病毒；使用包裝好的慢病毒感染肝組織細胞。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述酒體微量成分的濃度范圍為0ug/mL～400ug/mL。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述酒體微量成分選自乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、異丁酸、正丁酸、丙酮酸異戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、氯離子、己酸、硝酸根、蘋果酸、酒石酸、硫酸根、草酸、富馬酸、磷酸、檸檬酸、正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、戊醇、異戊醇、β-苯乙醇、有丙三醇、2，3-丁二醇、赤蘚醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、乙醛、乙縮醛、1,1-二乙氧基異丁烷、1,1-二乙氧基異戊烷、丙醛、異丁醛、異戊醛、糠醛、丁二酮、己酮、2,3-丁二酮、3-羥基丁酮、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊酸乙酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、苯甲醛、β-苯乙醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯酚、愈創苯酚、苯甲酸、香草酚、糠酸、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、谷氨酸、丙氨酸、門冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、甘氨酸中的一種或多種。

6.根據權利要求1所述的方法，其中進所述樣品可選食用酒精標準溶液和/或酒樣。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述酒樣均為50％alc/vol。

8.根據權利要求6所述的方法，其中所述食用酒精標準溶液的制備方法為用精餾和活性炭去除俄羅斯伏特加原酒中所有微量成分，只保留乙醇和水，再與超純水配制成各種酒精度的溶液。

9.根據權利要求1所述的方法，其中使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光，待顯微成像后，紅綠熒光混合形成的黃色斑點即為自噬體，綠色熒光減少即為自噬流水平上調。

10.根據權利要求1-9任一項所述的方法在評價酒精飲料對健康影響中的應用。