[發明專利]評價酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法

在審

• 申請號: 202310098248.5
• 申請日: 2023-02-10
• 公開（公告）號: CN116203002A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 黃和強;陳杉彬;李善文;韓興林;王德良;馮聲寶;趙文梅
• 申請（專利權）人: 青海互助天佑德青稞酒股份有限公司;中國食品發酵工業研究院有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/02;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62
• 代理公司: 北京瀚群律師事務所 11581
• 代理人: 毛軍

本申請用于食品領域，公開了一種評價酒體微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法，包括以下步驟：步驟一、配制穩定表達GFP?RFP?LC3蛋白的人肝細胞(LO2)單細胞懸液；步驟二、將1.5×10⁴cell/mL的該LO2細胞接種于6孔板中蓋玻片培養24h至貼壁；步驟三、加入2mL含80μL純酒精或含不同酒體微量成分酒樣的細胞培養，37℃,5％CO₂條件培養24h。步驟四、4％多聚甲醛中固定15min。步驟五、PBS清洗玻片晾干后滴加含DAPI的防淬滅劑，爬滿細胞的一面置于防淬滅劑上。步驟六、激光共聚焦顯微鏡觀察紅綠熒光，根據不同熒光判斷酒體微量成分對細胞自噬的影響。本申請通過上述觀察不同熒光能夠快速評價酒體中微量成分對細胞自噬水平的影響程度。

發明領域：

本發明涉及食品領域，具體涉及一種評價酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法。

背景技術：

相較于其它蒸餾酒，白酒除主要成分乙醇外，含有更為豐富的風味物質，包括2000多種微量化合物，風味成分占總質量的2％-3％，其中有多種功能組分，包括多酚類、萜烯類、吡嗪類、多肽等活性成分。乙醇不具備緩解心臟類疾病的功能，這種功能可能更多的受到其它微量成分的影響，如白藜蘆醇具有抗氧化、預防心血管疾病、延長人體器官壽命的功能；4-乙基愈創木酚可通過調控促炎信號通路、減少炎性細胞因子；葉基丙酮、β-石竹烯能夠提高機體內非酶系統抗氧化劑GSH的濃度，同時提高細胞的抗氧化能力；脂肽類化合物具有一定的抗癌、抗病毒的能力。

細胞自噬是一種基本的細胞代謝過程，可以促進細胞穩態平衡、分化、發育和生存過程。它通過溶酶體來降解包括核酸、蛋白質、脂質和細胞器等分子和亞細胞組分進而維持細胞存活。自噬是一種與維持細胞組織穩態相關的高度選擇性細胞清除途徑，與健康密切相關，尤其體現在衰老、疾病等方面。自噬受損被認為是衰老的標志之一，同時對長壽突變體動物的研究表明，衰老延緩與自噬增加有關，利用遺傳或藥理學手段上調自噬水平可延長動物壽命。過量酒精攝入可以引起酒精性肝損傷甚至肝細胞癌，進而破壞體內蛋白質，導致疾病與衰老等負面影響出現。脂質代謝中的自噬功能受損是脂質過氧化和細胞損傷的病理基礎。酒精性脂肪肝是由于過度飲酒而導致肝臟氧化應激，肝細胞中積累過多的脂滴(脂肪變性)，線粒體損傷和細胞死亡的損害。自噬作為一種防御機制能夠防止脂質過氧化，從而保護肝細胞。中國白酒或可通過影響細胞自噬活性而作用于肝細胞，減緩損傷。

目前對飲酒健康標準沒有統一，實驗流程沒有確立，通過動物實驗對飲酒健康展開除需要考慮個體差異外，還應考慮較高的實驗成本，較為漫長的實驗過程，不利于企業和消費者對酒體及成分進行快速便捷的健康評價。因此，本申請提供一種有效且快速的評價酒精飲料中酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法，用于快速便捷推進酒體健康設計，迎合飲酒健康消費需求。

發明內容

針對以上需求，發明人制備了可穩定表達GFP-RFP-LC3蛋白的人正常肝細胞，使用含有酒體中不同微量成分的不同酒樣分別完成對該細胞的處理。使用激光共聚焦顯微鏡觀測細胞形貌，分析對表達GFP-RFP-LC3蛋白的人正常肝細胞細胞自噬水平的影響程度，能夠快速且簡單有效的初步評價酒體中不同微量成分水平對健康的影響程度。

一方面，本申請提供了一種評價酒體中不同微量成分對細胞自噬水平影響程度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、將對數生長期能夠穩定表達GFP-RFP-LC3蛋白的人肝細胞L02用胰蛋白酶消化，配制成單細胞懸液；

步驟二、在6孔板中每個孔均勻放置3個蓋玻片Micro?Cover?Glass，在6孔板孔中先加少量培養基(以使玻片與培養皿緊密接觸)，使玻片緊密貼合，按1.5×10⁴cell/mL的密度將能穩定表達GFP-RFP-LC3的LO2細胞接種于6孔板中，每孔1mL。蓋上6孔板后置于在37℃,5％?CO₂條件下進行培養24h至細胞貼壁；