[發明專利]一種基于回折crRNA的超短鏈miRNA檢測方法及系統

在審

• 申請號: 202310091133.3
• 申請日: 2023-01-13
• 公開（公告）號: CN116287129A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 劉翼振;陳勇;張奕濱
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/6876;C12N15/113
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 溫宏梅

本發明提供了一種基于回折crRNA的超短鏈miRNA檢測方法及系統，利用針對待檢測miRNA的crRNA的3'端尾部回折設計，滿足“激活Cas13酶的HEPN結構域中的催化位點”的長度要求，從而實現檢測超短鏈miRNA，并直接啟動Cas13酶的非特異性反式切割活性實現檢測信號讀出。本發明的檢測方法突破了CRISPR/Cas13酶檢測長度極限，適配任何長度的miRNA，且具有設計簡單、操作簡便和實時監測的優點。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種基于回折crRNA的超短鏈miRNA檢測方法及系統。

背景技術

MicroRNAs(miRNAs)是廣泛存在于動物、植物和病毒中的一類由17-22個核苷酸組成的非編碼RNA，它在多種生物學過程中發揮重要的調控作用，包括：免疫系統、細胞發育、增值分化和細胞凋亡等。目前已經發現2600多種調節生物過程各個環節的miRNAs存在于人體內。miRNAs的異常表達與多種癌癥疾病密切相關，是癌癥診斷的重要生物標志物，因此，miRNAs的早期檢測對于基礎生物研究、疾病預后和分子診斷具有重要意義。

傳統的miRNAs檢測方法包括：RNA印跡(Northern?blotting)、實時定量PCR(quantitative?real?time?PCR，qRT-PCR)和微陣列。RNA印跡是最早的基于雜交技術分析miRNAs表達的嘗試方法，RNA印跡因其無需擴增、檢測過程中序列中的堿基不改變的特點，所以其檢測結果具有較高可信度，但是其檢測需要大量的RNA樣本，并且實驗過程中RNA易降解；實時定量PCR被認為是miRNAs檢測的金標準，然而，成熟的miRNAs序列較短，無法按照常規方法設計引物進行逆轉錄和擴增；微陣列(microarray)也可以對miRNAs進行快速、高通量檢測，但由于miRNAs序列較短，探針和miRNAs雜交形成的雙鏈產物的熔解溫度(Tm)較低，增加了錯配的幾率。所以，發展新的miRNAs檢測方法勢在必行。

成簇的規律成簇的間隔短回文重復序列(Clustered?Regularly?InterspacedShort?Palindromic?Repeats,CRISPR)相關蛋白(CRISPR-associated?protein,Cas)系統作為一種革命性的基因編輯技術，已被廣泛應用于臨床醫學的各個領域。該系統除了具有非凡的基因編輯能力之外，Cas12、Cas13、Cas14還表現出優異的核酸識別性能和活化后的非特異性核酸切割功能，這使其為下一代高靈敏且快速的核酸檢測技術提供了廣闊的應用前景。例如，一系列的Cas效應子包括Cas12a、Cas13a已被開發來建立基于CRISPR-Cas的MicroRNAs生物傳感檢測，邢達等人利用CRISPR/LbuCas13a以高特異性和簡單性直接檢測miR-17，該方法直接識別靶標RNA可以避免基因組DNA的污染，最終這種一步法可以在30分鐘內實現檢測限低至4.5阿摩爾；唐波等人開發了一個整合CRISPR-Cas12a和個人血糖計(personal?glucose?meter,PGM)的檢測策略實現對miR-21和miR-205的高靈敏檢測，該策略利用了雙鏈特異性核酸酶(duplex-specific?nuclease,DSN)實現對靶標信號的轉換和放大，該方法對miR-21和miR-205的檢測限為2.4pM和1.1pM。

然而，研究表明，不同的Cas13酶對于“激活HEPN結構域內的催化位點”所要求的“crRNA-靶標”雙鏈體的堿基對(bp)長度是不同的，例如：當使用LwaCas13a和LshCas13a檢測小于22nt的靶標長度時未顯示反式切割活性，而20bp的“crRNA-靶標”雙鏈體對于激活LbuCas13a的HEPN結構域內的催化位點以反式切割ssDNA是必不可少的；此外，由于miRNAs本身長度的影響導致無法通過常規逆轉錄直接生成Cas12酶可以識別的產物，到目前為止，還沒有關于突破CRISPR/Cas13酶檢測長度極限并識別超短鏈MicroRNAs的報道。

因此，現有技術還有待改進。

發明內容