[發(fā)明專(zhuān)利]一種在酵母中異源表達(dá)的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶、重組菌及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310086842.2
• 申請(qǐng)日: 2023-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116478967A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 榮紹豐;王珂鑫;管世敏;蔡保國(guó);李茜茜;黃煜玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/42
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12P19/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海申匯專(zhuān)利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

本發(fā)明公開(kāi)了一種在酵母中異源表達(dá)的內(nèi)切β?1,3?葡聚糖酶、重組菌及應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)一種來(lái)自白粉菌屬的內(nèi)切β?1,3?葡聚糖酶基因進(jìn)行優(yōu)化，獲得了密碼子優(yōu)化的RE.Glu?13，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，氨基酸序列如SEQ?IDNO:2。將將優(yōu)化后的目的基因RG.Glu?13連接到pPIC9K質(zhì)粒上，最終轉(zhuǎn)入酵母MF060中，獲得重組菌株。發(fā)酵該菌株外分泌表達(dá)內(nèi)切β?1,3?葡聚糖酶，優(yōu)化高密度發(fā)酵過(guò)程中甲醇和甘油的流加方式，提高了內(nèi)切β?1,3?葡聚糖酶的表達(dá)量。該內(nèi)切β?1,3?葡聚糖酶對(duì)酵母β?葡聚糖具有較高內(nèi)切酶活性，可以制備分子量范圍較窄的酵母β?葡寡糖。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在酵母中異源表達(dá)的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶、重組菌及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-葡聚糖是一種通過(guò)β-糖苷鍵連接D-葡萄糖結(jié)構(gòu)單元形成的非淀粉多糖，分子量在6.5×10⁴～3.1×10⁶Da，水溶性差。糖分子中存在β-1,3-糖苷鍵、β-1,4-糖苷鍵、以及β-1,6-糖苷鍵三種β-葡聚糖糖苷鍵。在化妝品行業(yè)中，β-葡聚糖作為保濕劑，能夠在皮膚表層形成保護(hù)膜，起到防止水分流失，保濕補(bǔ)水的作用。研究表明，β-葡聚糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活免疫細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞增殖，從而修復(fù)皮膚損傷，促進(jìn)傷口愈合。但是大分子β-葡聚糖較難透過(guò)皮膚被深層細(xì)胞利用，實(shí)現(xiàn)葡聚糖的抗衰、消炎等功能。這就要求對(duì)β-葡聚糖進(jìn)行小分子化，才可以激活免疫細(xì)胞，有效的修復(fù)皮膚，延緩皮膚衰老。

目前主要通過(guò)化學(xué)修飾(磷酸化、羧甲基化等)對(duì)葡聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，起到增溶的效果，但是會(huì)使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致生物活性降低；通過(guò)酸解、堿解等方法水解大分子葡聚糖，所得產(chǎn)物分子量分布較廣，且產(chǎn)物中會(huì)有部分化學(xué)試劑殘留。發(fā)酵法可以降低外源雜質(zhì)引入，獲得可溶性β-葡寡糖；而且通過(guò)高密度發(fā)酵，可以將內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)業(yè)化，解決葡聚糖酶活性低，生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。

目前β-葡聚糖酶主要涉及羧甲基纖維素鈉、木聚糖、低聚龍膽糖的制備，且大多為外切酶活性。外切酶酶解葡聚糖產(chǎn)物為單糖與分子量分布較寬的小分子葡聚糖，無(wú)法獲得一種較窄分子量范圍的葡寡糖產(chǎn)物；而內(nèi)切酶會(huì)對(duì)葡聚糖進(jìn)行隨機(jī)內(nèi)切，不會(huì)有單糖產(chǎn)生，而且可以得到分子量范圍比較窄的葡寡糖。目前針對(duì)酵母β-葡聚糖底物進(jìn)行酶解的單一內(nèi)切酶活性的β-1,3-葡聚糖酶較少，已知的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的異源表達(dá)量較低且酶活沒(méi)有達(dá)到理想水平，缺乏一種可異源高效表達(dá)針對(duì)酵母β-葡聚糖底物進(jìn)行酶解的β-1,3-葡聚糖酶葡聚糖酶的菌株載體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：針對(duì)目前內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的異源表達(dá)量較低且酶活不高的缺陷，本發(fā)明提出一種在酵母中異源表達(dá)的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶、重組菌(基因工程菌)，該β-內(nèi)切葡聚糖酶可在酵母中異源高效表達(dá)內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶，對(duì)酵母β-葡聚糖底物具有較高內(nèi)切酶活性，可以降低酵母β-葡聚糖的分子量，增加其溶解度，得到分子量范圍較窄的酵母β-葡寡糖產(chǎn)物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是提供一種在酵母中異源表達(dá)的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，所述內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的核苷酸序列如SEQ?IDNO:1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2。

優(yōu)選地，內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13基因的合成引物包括如SEQ?ID?NO:3所示的正向引物和如SEQ?ID?NO:4所示的反向引物。

本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體能夠表達(dá)上述內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13。

本發(fā)明還提供了一種基因工程菌，為攜帶上述重組表達(dá)載體的酵母菌。

優(yōu)選地，所述基因工程菌為酵母菌MF060/pPIC9K/RG.Glu-13，其保藏編號(hào)為CCTCCNO：M?20221817。