[發(fā)明專利]一種在酵母中異源表達的內切β-1,3-葡聚糖酶、重組菌及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310086842.2
• 申請日: 2023-01-19
• 公開（公告）號: CN116478967A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設計）人: 榮紹豐;王珂鑫;管世敏;蔡保國;李茜茜;黃煜玲
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12P19/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

1.一種在酵母中異源表達的內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，其特征在于，所述內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2。

2.如權利要求1所述的在酵母中異源表達的內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，其特征在于，內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13基因的合成引物包括如SEQ?ID?NO:3所示的正向引物和如SEQ?ID?NO:4所示的反向引物。

3.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體能夠表達權利要求1所述的內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13。

4.一種基因工程菌，其特征在于，為攜帶權利要求2所述的重組表達載體的酵母菌。

5.如權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為酵母菌MF060/pPIC9K/RG.Glu-13，其保藏編號為CCTCC?NO：M?20221817。

6.權利要求1所述的在酵母中異源表達的內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，權利要求3所述的重組表達載體，權利要求4所述的基因工程菌在制備酵母β-葡寡糖中的應用。

7.一種高密度發(fā)酵培養(yǎng)內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：將單菌落基因工程菌接入YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心，收集菌體，其中，所述基因工程菌為權利要求4所述的基因工程菌；

步驟2：將步驟1所得菌體接入BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心，收集菌體，其中，培養(yǎng)過程中添加甘油，甘油的添加方式為：BMGY培養(yǎng)基中初始甘油濃度為10％，每次甘油耗盡后，添加量按照10％梯度增長；

步驟3：將步驟2所得菌體接入BMMY培養(yǎng)基中發(fā)酵誘導培養(yǎng)，該過程中通過流加甲醇進行誘導；

步驟4：將步驟3所得的發(fā)酵液依次經(jīng)過離心、微濾膜過濾除雜和超濾濃縮后，得到內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液。

8.如權利要求7所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法，其特征在于，所述步驟3中流加甲醇的方式為：

甲醇誘導過程0-2h，按照2.5‰v/v比例每小時流加100％甲醇；

甲醇誘導過程3-9h，按照3‰v/v比例每小時流加100％甲醇；

甲醇誘導過程9-24h，按照5‰v/v比例每小時流加100％甲醇；

甲醇誘導過程24-30h，按照5.5‰v/v比例每小時流加100％甲醇；

甲醇誘導過程30-96h，按照6‰v/v比例每小時流加100％甲醇。

9.一種通過酶解酵母β-葡聚糖制備酵母β-葡寡糖的方法，其特征在于，利用權利要求8所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法獲得的內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液對酵母β-葡聚糖進行酶解，具體包括：用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配置酵母β-葡聚糖溶液，按照如下反應體系進行酶解：

20mM?Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，內切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液添加比例為10-30％，酵母β-葡聚糖終濃度為30-100g/L；反應體系溶液的pH值為5.2-6.2；反應體系溶液的溫度為50-60℃；反應時間為3-30h。