[發明專利]一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法

在審

• 申請號: 202310083593.1
• 申請日: 2023-02-08
• 公開（公告）號: CN116296587A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 邵儉;姚鄧雕;王藝舟;龐秀清;許龍飛;董響紅;王楨璐;張木子;楊原偉;姜海波
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N1/14
• 分類號: G01N1/14;A61L2/18;A61L9/14;C12M1/26;C12M1/12;C12M1/00;A61L101/06
• 代理公司: 北京紅梵知識產權代理事務所(普通合伙) 11912
• 代理人: 李雅

本發明公開了一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法，包括以下步驟：第一步，工作人員在采樣前須佩戴一次性無菌手套，在采樣點充分潤洗采水器和塑料桶3~5次；第二步，用采水器采集水樣并倒入潤洗過的塑料桶內，裝2?L水于無菌廣口瓶中，隨后立即進行低溫避光保存處理；第三步，使用隔膜真空泵和砂芯玻璃過濾裝置抽濾水樣；第四步，抽濾工作完成后，水樣中的eDNA富集于濾膜上，用鑷子將濾膜卷起置于無菌離心管中在?20℃條件下保存。該發明結合喀斯特高原湖泊特殊的生態系統提出了一種水體環境DNA的采樣方法，為喀斯特高原湖泊開展生物多樣性調查提供了一種準確高效且經濟的調查采樣方法。

技術領域

本發明涉及水樣采集技術領域，具體為一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法。

背景技術

喀斯特湖泊，又稱“巖溶湖”，由喀斯特作用（巖溶作用）所形成的洼地積水而成的湖泊，是侵蝕湖的一種。它可以是由具有溶蝕性的水對可溶巖進行溶蝕作用后，形成了洼地積水，也可以是由地下水溶解土壤中的鹽類引起塌陷而生成塌陷湖。喀斯特湖主要靠地下水供水，水量一般較穩定。喀斯特水文系統是一個發育于溶巖含水層中獨特的水文系統，它與其他水文系統相比具有高度的敏感性和脆弱性（袁道先,2001）。

高原上同樣也分布著喀斯特湖泊，喀斯特高原湖泊魚類生物多樣性豐富。近現代以來，隨著城鎮化和工業化的進行，我國西南喀斯特地區生態環境逐漸遭到破壞，這也造成了這些區域成為瀕危物種最集中的地區之一（王波等，2018）。傳統魚類多樣性的調查研究方法主要靠垂釣、網捕、電擊等采集方法，對生物多樣性的保護造成不同程度的入侵和破壞，且由于喀斯特高原湖泊構造復雜往往導致采樣耗時費力，難度極大，相關研究工作進展緩慢。環境DNA技術具有靈敏度高、效率高、成本低等特點，該項技術近幾年來已成為開展生物多樣性研究的重要方法，利用環境DNA技術可以開展高原喀斯特湖泊的魚類多樣性的研究工作，而且滿足當前生物多樣性資源保護的科學需求。但對于目前環境DNA采樣的技術方法而言，環境DNA的樣品仍然存在著交叉污染或外源DNA污染和DNA降解的風險，這會嚴重影響實驗的嚴謹性和分析結果的準確性。

所以我們提出了一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法，以便于解決上述中提出的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法，以解決上述背景技術提出的目前市場上的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種喀斯特高原湖泊水環境DNA樣品的現場采集方法，包括以下步驟：

第一步，工作人員在采樣前須佩戴一次性無菌手套，在采樣點充分潤洗采水器和塑料桶3~5次；

第二步，用采水器采集水樣并倒入潤洗過的塑料桶內，裝2?L水于無菌廣口瓶中，隨后立即進行低溫避光保存處理；

第三步，使用隔膜真空泵和砂芯玻璃過濾裝置抽濾水樣，采用濾膜富集eDNA，進行抽濾工作之前須用1%次氯酸溶液對抽濾操作工作臺和周圍3?m內的空氣進行消毒，隨后進行真空抽濾；

第四步，抽濾工作完成后，水樣中的eDNA富集于濾膜上，用鑷子將濾膜卷起置于無菌離心管中在-20℃條件下保存。

優選的，所述第二步中，若水深≤5?m，采集深度為1?m的水樣；若水深大于5?m且小于10?m，采集深度為1?m和5?m水深的水樣于桶內混合待用；若水深≥10?m，分別采集1?m、5m、10?m水深水樣混合待用。

優選的，所述第四步中，每一瓶樣品抽濾結束之后均用蒸餾水清洗砂芯玻璃并更換一次性無菌手套，設置1個空白對照。