[發明專利]一種生產觀藍的基因工程菌株及應用

有效

• 申請號: 202310077165.8
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN116064363B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 吳蘊;華夏;李亞
• 申請（專利權）人: 徐州合谷生命科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/52;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 南京聚匠知識產權代理有限公司 32339
• 代理人: 耿英

本發明公開了一種生產觀藍的基因工程菌株和發酵方法，該基因工程菌株IN06，由表達載體pRk?bpsA?EntD/95s?glnA導入底盤菌株IN05構建而得；盤菌株IN05，以大腸桿菌BW25113為起始菌株，將大腸桿菌利用丙酮酸為碳源和能量的代謝路基的基因敲除或者原位突變構建而得，所述表達載體pRk?bpsA?EntD/95s?glnA，以pRk、95s分別為質粒模板，藍色素合成酶bpsA、磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD及谷氨酰氨合成酶glnA為功能基因，經基因合成、優化、擴增構建而得。本發明的基因工程菌株，利用葡萄糖為底物，在體內直接生物合成觀藍，降低成本，綠色環保，無化學殘留。

技術領域

本發明涉及一種生產觀藍的基因工程菌株及應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

觀藍是一種天然藍色素，結構式為主要應用于染料行業。

目前，染料行業所使用的染料仍以工業染料靛藍為主，但工業靛藍的生產是以化學合成法為主，主要原料為苯胺，對人體的危害較大，所產生的污染較為嚴重，是工業污染的重要源頭之一，而微生物發酵生產藍色素污染較少且成本較低，已逐步成為工業靛藍的替代方案，但是目前行業內微生物發酵生產觀藍的產量較低，且成本較高，尚不能工業應用。為了降低成本，實現工業化應用，本發明公開了一種生產觀藍的基因工程菌株和發酵方法。

發明內容

針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種生產觀藍的基因工程菌株和發酵方法，以葡萄糖為底物，在工程菌株IN06體內直接生物合成觀藍，降低成本，安全穩定，綠色環保，產品純度高，無化學殘留。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種生產觀藍的基因工程菌株和發酵方法，該基因工程菌株，即工程菌株IN06，是由表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA導入底盤菌株IN05構建而得；

其中，所述底盤菌株IN05，是以大腸桿菌BW25113為起始菌株，將大腸桿菌利用丙酮酸為碳源和能量的代謝路基的基因敲除或者原位突變構建而得，以增強中心代謝，促進關鍵蛋白的翻譯后修飾；

所述表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA，是以質粒pRk、藍色素合成酶bpsA以及磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD分別經擴增、基因合成、優化后連接而得的目的基因片段pRk-bpsA-EntD與以質粒95s與谷氨酰氨合成酶glnA經基因合成、優化、擴增而得的的基因片段95s-glnA構建而得。

優選地，所述底盤菌株IN05的構建方法，具體的步驟如下：

s1、以大腸桿菌BW25113為起始菌株，插入標簽基因篩選prpB基因，敲除prpB基因，并命名為菌株IN01；

s2、在菌株IN01基礎上，插入標簽基因篩選prpC基因，敲除prpC基因，并命名為菌株IN02；

s3、在菌株IN02基礎上，插入標簽基因篩選prpD基因，敲除prpD基因，消除大腸桿菌利用丙酮酸作為碳源和能量的能力，并命名為菌株IN03；

s4、將磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp基因經PCR擴增，獲得基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp，再以95s為質粒模板，將基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp與質粒95s連接，獲得表達質粒95s-sfp，獲得表達質粒95s-sfp，再選用119啟動子對表達質粒95s-sfp進行定點突變，獲得質粒95s-119-sfp；

s5、在菌株IN03基礎上，插入標簽基因篩選prpR基因，繼續敲除prpR基因，并在該基因位點引入質粒95s-119-sfp，并命名為菌株IN04；

s6、在菌株IN04基礎上，插入標簽基因篩選prpE基因，選用119啟動子在prpE基因上進行原位突變，獲得底盤菌株，并命名為底盤菌株IN05。