[發(fā)明專利]一種生產觀藍的基因工程菌株及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310077165.8
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN116064363B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 吳蘊;華夏;李亞
• 申請（專利權）人: 徐州合谷生命科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/52;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 南京聚匠知識產權代理有限公司 32339
• 代理人: 耿英

1.一種生產觀藍的基因工程菌株其特征在于，該基因工程菌株，即工程菌株IN06，是由表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA導入底盤菌株IN05構建而得；

其中，所述底盤菌株IN05的構建方法，具體的步驟如下：

s1、以大腸桿菌BW25113為起始菌株，敲除prpB基因，并命名為菌株IN01；

s2、在菌株IN01基礎上，敲除prpC基因，并命名為菌株IN02；

s3、在菌株IN02基礎上，敲除prpD基因，并命名為菌株IN03；

s4、將磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp基因經PCR擴增，獲得基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp，再以95s為質粒模板，將基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶sfp與質粒95s連接，獲得表達質粒95s-sfp，獲得表達質粒95s-sfp，再選用119啟動子對表達質粒95s-sfp進行定點突變，獲得質粒95s-119-sfp；

s5、在菌株IN03基礎上，繼續(xù)敲除prpR基因，并在該基因位點引入質粒95s-119-sfp，并命名為菌株IN04；

s6、在菌株IN04基礎上，選用119啟動子在prpE基因上進行原位突變，獲得底盤菌株，并命名為底盤菌株IN05；

所述表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA，是以質粒pRk、藍色素合成酶bpsA以及磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD分別經擴增、基因合成、優(yōu)化后連接而得的目的基因片段pRk-bpsA-EntD與以質粒95s與谷氨酰氨合成酶glnA經基因合成、優(yōu)化、擴增而得的的基因片段95s-glnA構建而得。

2.根據權利要求1所述的一種生產觀藍的基因工程菌株，其特征在于，所述表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA的構建方法，具體的步驟如下：

S1、將藍色素合成酶bpsA先進行基因合成，再進行密碼子優(yōu)化，再經PCR擴增，得到基因片段藍色素合成酶bpsA；將磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD先進行基因合成，再進行密碼子優(yōu)化，再經PCR擴增，得到基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD；再以質粒pRk為模板，質粒pRk先進行基因合成，再進行密碼子優(yōu)化，再反義PCR擴增，得到基因片段質粒pRk，接著將基因片段質粒pRk、基因片段藍色素合成酶bpsA、基因片段磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶EntD進行連接，得到目的基因片段pRk-bpsA-EntD；

S2、以95s為質粒模板，與谷氨酰氨合成酶glnA進行基因合成，后進行密碼子優(yōu)化，再經PCR擴增，得到目的基因片段95s-glnA；

S3、將目的基因片段pRk-bpsA-EntD和目的基因片段95s-glnA進行連接，后經篩選RBS序列，得到表達載體pRk-bpsA-EntD/95s-glnA。

3.根據權利要求1或2所述的一種生產觀藍的基因工程菌株，其特征在于，在基因敲除或基因突變，需要插入的標簽基因，所述標簽基因為重復序列，(CAXGGXTCXATGTCXTGG)n，X為任意堿基，n可為1、2、3、4、5或6，標簽基因相似度為80％-100％。

4.一種根據權利要求1所述的一種生產觀藍的基因工程菌株的應用，其特征在于，所述工程菌株IN06應用生產觀藍。

5.根據權利要求4所述的一種生產觀藍的基因工程菌株應用，其特征在于，采用搖瓶培養(yǎng)的方式生產觀藍，具體的步驟如下：活化上述的工程菌株IN06，以1％接種量接種至50ml搖瓶培養(yǎng)基內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內加入卡那霉素和鏈霉素，當阿拉伯糖的終濃度為4mg/L時，在搖床內進行誘導，搖床溫度為30℃、轉速為225rpm，誘導表達16h，誘導結束后，得到觀藍搖瓶培養(yǎng)液；所述搖瓶培養(yǎng)基為ZYM培養(yǎng)基。