[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)宮頸癌相關(guān)基因PAX1甲基化的引物探針、方法和試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310072061.8
• 申請(qǐng)日: 2023-02-07
• 公開（公告）號(hào): CN116287244A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡嘉慧;王淑一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關(guān)壽

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)宮頸癌相關(guān)基因PAX1甲基化的引物、探針、試劑盒和方法。本發(fā)明所述的甲基化擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增PAX1基因啟動(dòng)子和外顯子1上的CG位點(diǎn)富集區(qū)域，探針序列上有5個(gè)CG位點(diǎn)。本發(fā)明試劑盒包括所述的PAX1甲基化引物和探針，還包括內(nèi)參基因ACTB的引物和探針。與常規(guī)的宮頸癌檢測(cè)相比，本發(fā)明的單管熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，能幫助臨床醫(yī)生更加精準(zhǔn)評(píng)估宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)，做到早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)宮頸癌相關(guān)基因PAX1甲基化檢測(cè)的引物、探針、方法和試劑盒，以利于患者早期診斷。

背景技術(shù)

宮頸癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位。高危型人類乳頭瘤病毒(high-risk?human?papillomavirus，Hr-HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌的病因，但宮頸上皮的癌變過程還與其他基因和表觀基因的改變有關(guān)。DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)最早的種表觀遺傳方式，它能夠在不改變核酸序列的情況下，改變基因表達(dá)水平，是研究最為深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，也是表觀遺傳的最主要形式。

目前幾乎所有腫瘤都已發(fā)現(xiàn)特異性的基因甲基化標(biāo)記物，最早的是結(jié)直腸癌的S9(Septin9)基因甲基化檢測(cè)獲FDA認(rèn)證。DNA甲基化過程是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的活性甲基與胞嘧啶鳥嘌呤磷酸二核苷酸(CpG)5'末端的C原子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾。經(jīng)過甲基化修飾的胞嘧啶其堿基位置不會(huì)改變，但基因的表達(dá)會(huì)造成一些影響，從而抑制轉(zhuǎn)錄過程。胞嘧啶鳥嘌呤磷酸二核苷酸在人體內(nèi)有兩種存在形式，其中一種呈現(xiàn)分散型，叫做CpG位點(diǎn)，以甲基化的形式存在；另一種為CpG島，CpG位點(diǎn)聚集成簇形成CpG島，是一個(gè)GC含量超過55％的DNA序列區(qū)域，主要位于基因的啟動(dòng)子(promoter)和第一外顯子區(qū)域，約有60％以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。CpG島在健康人體細(xì)胞中以去甲基化的形式存在，但是在癌癥患者體內(nèi)，存在抑癌基因和(或)原癌基因的異常甲基化，抑制轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致腫瘤抑制功能的喪失，使得細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)展無法控制。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中存在典型的腫瘤抑制基因的DNA異常甲基化，包括PAX1，SOX1和ZNF582等，PAX1基因位于染色體20p11號(hào)染色體上，由一個(gè)配對(duì)結(jié)構(gòu)域(PD)和一個(gè)八肽結(jié)構(gòu)域(OP)組成，是轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)盒家族中的一員，負(fù)責(zé)細(xì)胞調(diào)控分化成熟。有研究表明，PAX1在宮頸癌組織中的甲基化頻率非常高，且PAX1甲基化水平會(huì)隨著宮頸癌病變程度的加深而逐漸升高。

常規(guī)宮頸癌最主要的初步篩查手段是液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(TCT)和HPV檢測(cè)，初步篩查有問題可以進(jìn)一步做陰道鏡取宮頸活檢做病理化驗(yàn)，病理組織學(xué)診斷仍是診斷宮頸癌的金標(biāo)準(zhǔn)。但TCT和HPV檢測(cè)這兩項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目均有缺點(diǎn)，TCT檢測(cè)靈敏度低，HPV檢測(cè)特異性較差，且HPV檢測(cè)陽(yáng)性并不意味著患癌，HPV檢測(cè)為陽(yáng)性的高危患者從HPV感染到宮頸癌的發(fā)病十分漫長(zhǎng)，且真正是宮頸癌前高度病變的患者較少。PAX1甲基化檢測(cè)通過采集女性宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可精準(zhǔn)檢測(cè)宮頸癌前病變，可以輔助臨床診斷，幫助醫(yī)生更加精準(zhǔn)評(píng)估Hr-HPV陽(yáng)性患者的癌變風(fēng)險(xiǎn)，另外，由于宮頸管內(nèi)的病變及腺癌難以被現(xiàn)有檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，PAX1甲基化檢測(cè)可以減少細(xì)胞學(xué)診斷的漏診，做到早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療。對(duì)于患者而言，PAX1甲基化檢測(cè)可以減少患者對(duì)HPV檢測(cè)陽(yáng)性的恐慌，造成不必要的精神負(fù)擔(dān)與經(jīng)濟(jì)損失。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)宮頸癌相關(guān)基因PAX1甲基化的引物探針、方法和試劑盒。

本發(fā)明的目的之一是提供了一種用于檢測(cè)宮頸癌相關(guān)基因PAX1甲基化的檢測(cè)引物，所述檢測(cè)引物的堿基序列為：

PAX1-F：GGGYGTAGTGAYGGGAATT

PAX1-R：ACRTATCCTCCACRTCAATCT

還包括一對(duì)內(nèi)參基因ACTB的特異性引物，所述特異性引物的堿基序列為：