[發明專利]一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的引物探針、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202310072061.8
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN116287244A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 蔡嘉慧;王淑一
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關壽

本發明涉及一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的引物、探針、試劑盒和方法。本發明所述的甲基化擴增引物用于擴增PAX1基因啟動子和外顯子1上的CG位點富集區域，探針序列上有5個CG位點。本發明試劑盒包括所述的PAX1甲基化引物和探針，還包括內參基因ACTB的引物和探針。與常規的宮頸癌檢測相比，本發明的單管熒光定量PCR檢測方法特異性和靈敏度較高、重復性好，操作簡單，能幫助臨床醫生更加精準評估宮頸病變風險，做到早診斷、早發現、早預防、早治療。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化檢測的引物、探針、方法和試劑盒，以利于患者早期診斷。

背景技術

宮頸癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發病率位于女性腫瘤的第二位。高危型人類乳頭瘤病毒(high-risk?human?papillomavirus，Hr-HPV)的持續性感染是宮頸癌的病因，但宮頸上皮的癌變過程還與其他基因和表觀基因的改變有關。DNA甲基化是發現最早的種表觀遺傳方式，它能夠在不改變核酸序列的情況下，改變基因表達水平，是研究最為深入的表觀遺傳調控機制之一，也是表觀遺傳的最主要形式。

目前幾乎所有腫瘤都已發現特異性的基因甲基化標記物，最早的是結直腸癌的S9(Septin9)基因甲基化檢測獲FDA認證。DNA甲基化過程是在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的催化作用下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的活性甲基與胞嘧啶鳥嘌呤磷酸二核苷酸(CpG)5'末端的C原子發生共價結合，從而對DNA進行甲基化修飾。經過甲基化修飾的胞嘧啶其堿基位置不會改變，但基因的表達會造成一些影響，從而抑制轉錄過程。胞嘧啶鳥嘌呤磷酸二核苷酸在人體內有兩種存在形式，其中一種呈現分散型，叫做CpG位點，以甲基化的形式存在；另一種為CpG島，CpG位點聚集成簇形成CpG島，是一個GC含量超過55％的DNA序列區域，主要位于基因的啟動子(promoter)和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。CpG島在健康人體細胞中以去甲基化的形式存在，但是在癌癥患者體內，存在抑癌基因和(或)原癌基因的異常甲基化，抑制轉錄，最終導致腫瘤抑制功能的喪失，使得細胞生長和腫瘤發展無法控制。研究發現宮頸癌中存在典型的腫瘤抑制基因的DNA異常甲基化，包括PAX1，SOX1和ZNF582等，PAX1基因位于染色體20p11號染色體上，由一個配對結構域(PD)和一個八肽結構域(OP)組成，是轉錄因子配對盒家族中的一員，負責細胞調控分化成熟。有研究表明，PAX1在宮頸癌組織中的甲基化頻率非常高，且PAX1甲基化水平會隨著宮頸癌病變程度的加深而逐漸升高。

常規宮頸癌最主要的初步篩查手段是液基細胞學檢測(TCT)和HPV檢測，初步篩查有問題可以進一步做陰道鏡取宮頸活檢做病理化驗，病理組織學診斷仍是診斷宮頸癌的金標準。但TCT和HPV檢測這兩項檢測項目均有缺點，TCT檢測靈敏度低，HPV檢測特異性較差，且HPV檢測陽性并不意味著患癌，HPV檢測為陽性的高危患者從HPV感染到宮頸癌的發病十分漫長，且真正是宮頸癌前高度病變的患者較少。PAX1甲基化檢測通過采集女性宮頸脫落細胞進行檢測，可精準檢測宮頸癌前病變，可以輔助臨床診斷，幫助醫生更加精準評估Hr-HPV陽性患者的癌變風險，另外，由于宮頸管內的病變及腺癌難以被現有檢測方法發現，PAX1甲基化檢測可以減少細胞學診斷的漏診，做到早診斷、早發現、早預防、早治療。對于患者而言，PAX1甲基化檢測可以減少患者對HPV檢測陽性的恐慌，造成不必要的精神負擔與經濟損失。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的引物探針、方法和試劑盒。

本發明的目的之一是提供了一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的檢測引物，所述檢測引物的堿基序列為：

PAX1-F：GGGYGTAGTGAYGGGAATT

PAX1-R：ACRTATCCTCCACRTCAATCT

還包括一對內參基因ACTB的特異性引物，所述特異性引物的堿基序列為：