[發明專利]一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的引物探針、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202310072061.8
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN116287244A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 蔡嘉慧;王淑一
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關壽

1.一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物的堿基序列為：

PAX1-F：GGGYGTAGTGAYGGGAATT

PAX1-R：ACRTATCCTCCACRTCAATCT；

還包括內參基因ACTB的特異性引物，所述特異性引物的堿基序列為：

ACTB-F：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT

ACTB-R：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA。

2.根據權利要求1所述的引物，其特征在于，所述探針的堿基序列為：

PAX1-P：5’-ACAATCACGCCGAAAACGCGCG-3’；

探針的5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ1；

還包括內參基因ACTB的探針，所述探針的堿基序列為：

ACTB-P：5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’；

探針的5’端標記有熒光報告基團HEX，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ1。

3.一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的特異性引物。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括權利要求2所述的檢測探針。

5.根據權利要求3所述檢測試劑盒，其特征在于，還包括10xT5?PCR?Mix和50×ROX?DyeII緩沖液、重亞硫酸鹽。

6.一種用于檢測宮頸癌相關基因PAX1甲基化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待測宮頸脫落細胞DNA；

(2)樣本DNA的硫化：將提取得到的樣本DNA進行重亞硫酸鹽硫化反應；

(3)重亞硫酸鹽硫化的DNA純化:將步驟(2)所得硫化DNA進行純化；

(4)單管熒光定量PCR反應：以步驟(3)中的純化DNA為模板，根據權利要求1和權利要求2所述特異性引物和探針在同一管內進行熒光定量PCR反應；

(5)判斷結果：

檢測ACTB的熒光信號HEX和PAX1的熒光信號FAM強度，以達到設定閾值時所需的循環次數Ct值作為判斷標準；待測樣本的內參基因ACTB通道有明顯的擴增曲線且Ct值＜36，判斷待測樣本有效；在待測樣本有效的前提下，PAX1基因甲基化檢測通道有明顯的擴增曲線，Ct值＜36可判斷為陽性，Ct值＞36可判斷為陰性。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述單管熒光定量PCR擴增，其反應體系為20ul：包括10x?PCR?mix?10ul，50x?ROX?DYE?II?0.4ul，ACTB基因上游引物0.2uM，ACTB基因下游引物0.2uM，ACTB基因探針0.2uM，PAX1基因上游引物0.15uM，PAX1基因下游引物0.15uM，PAX1基因探針0.3uM，純化DNA2ul，其余用H2O補足至20ul。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述單管熒光定量PCR擴增，反應條件為：95℃預變性2min；95℃10s，60℃32s，共45個循環；60℃時收集熒光。