[發明專利]一種用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針、數字PCR試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202310071282.3
• 申請日: 2023-01-16
• 公開（公告）號: CN115896296A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 王云沁;葛光君;王會敏;徐容;趙嘉麗
• 申請（專利權）人: 臻準生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 北京欣永瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 11450
• 代理人: 張慶敏;穆宏平

本發明公開了一種用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針、數字PCR試劑盒及檢測方法，包含序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的HER2基因檢測引物對和序列如SEQ?ID?NO:3所示的MGB探針，序列如SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5所示的內參基因EFTUD2檢測引物對和序列如SEQ?ID?NO:6所示的內參基因MGB探針。本發明僅通過一組HER2引物以及內參基因引物探針就能達到精準判讀HER2拷貝數是否發生變異，具有簡便易行，高靈敏度和穩定性、可重復的特點。

技術領域

本發明涉及生物醫學核酸檢測技術領域，特別是腫瘤靶向治療相關的基因檢測技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針、芯片式數字PCR試劑盒及檢測方法。

背景技術

HER2基因(人類表皮生長因子受體-2，Human?Epidermal?Growth?FactorReceptor-2)定位于染色體17q21，編碼分子量為185kDa的跨膜受體樣蛋白(HER2蛋白)，具有胞內跨膜酪氨酸激酶活性。在人體中HER2基因擴增引起HER2蛋白受體的過表達會促進細胞的生長和增殖，從而導致腫瘤發生，同時也會抑制細胞的凋亡致化療耐藥，誘導血管新生，提高細胞運動能力增強腫瘤的浸潤轉移作用。因此HER2是腫瘤免疫治療研究中的一個重要靶分子。有研究表明，在乳腺癌和胃癌中，HER2基因的陽性擴增比率分別為15～20％和10％～30％，在乳腺癌患者中，HER2陽性擴增的患者，惡化程度迅速，更易復發，預后較差，生存時間短。因此，特異的靶點藥物通過抑制HER2擴增，可延長HER2乳腺癌患者的存活率和改善轉移性或復發胃癌患者的病發程度。

免疫組織化學法(IHC)檢測HER2蛋白表達是目前最為常用的方法，它是用帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術，IHC法因其操作簡便、價格低廉、判讀方便、便于保存等優點，已廣泛應用于臨床病理診斷，但由于其檢測過程缺乏標準化，且結果易受組織處理、不同抗體的敏感性差異、觀察者主觀判斷的不同以及17號染色體多體的干擾的影響，常造成其檢測結果的差異。

相對而言，熒光原位雜交法(FISH)通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交，利用熒光檢測體系對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析，其檢測冷凍組織或福爾馬林固定、石蠟包埋組織的HER2基因擴增的穩定性較好，不易受組織處理等影響，且應用不同顏色的熒光信號同時標記HER2基因和17號染色體著絲粒，消除了17號染色體多體的干擾，然而FISH也存在檢測費用昂貴、熒光淬滅致結果無法長期保存、操作難度大，時間長、并且不利于病理醫生在暗視野下觀察組織細胞形態等缺點，從而導致HER2假陽性或假陰性的誤判等缺陷。

在當今PCR技術高速發展的時代，芯片式數字PCR(chip?digital?PCR，cdPCR)作為第三代PCR技術，是一種基于高通量的PCR技術，相較初代以及二代PCR，有極高的準確性，可以對較低濃度的樣本進行特異性檢出，同時基于高通量的的特點，做到對核酸濃度的絕對定量。

因此，可以開發相關利用數字PCR技術對HER2基因擴增檢測，提高對HER2表達狀態的準確檢測，更加準確的判斷HER2基因是否發生拷貝數變異。

發明內容

為了解決現有的HER2拷貝數變異檢測方法較繁復，且實驗結果難以復現，檢測結果出現假陽性和假陰性的問題，本發明目的是提供一種用于檢測HER2拷貝數變異的特異性引物探針，從而實現對HER2表達狀態的準確檢測，并在很大程度上避免假陽性和假陰性的檢測結果，從而更加準確的判斷HER2基因是否發生拷貝數變異。

本發明的另一目的是提供一種用于檢測HER2拷貝數變異的數字PCR試劑盒。

本發明的再一目的是提供一種基于dPCR的HER2拷貝數變異的檢測方法。

本發明的還一目的是提供一種所述特異性引物探針在制備用于檢測HER2拷貝數變異的試劑盒中的應用。