[發明專利]一種用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針、數字PCR試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202310071282.3
• 申請日: 2023-01-16
• 公開（公告）號: CN115896296A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 王云沁;葛光君;王會敏;徐容;趙嘉麗
• 申請（專利權）人: 臻準生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 北京欣永瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 11450
• 代理人: 張慶敏;穆宏平

1.一種用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針，其特征在于，包含序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的HER2基因檢測引物對和序列如SEQ?ID?NO:3所示的MGB探針，序列如SEQID?NO:4和SEQ?ID?NO:5所示的內參基因EFTUD2檢測引物對和序列如SEQ?IDNO:6所示的內參基因MGB探針。

2.根據權利要求1所述的引物探針，其特征在于，序列如SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:6所示的MGB探針分別標記熒光基團。

3.根據權利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述熒光基團選自FAM、HEX、ROX或CY5中的一種；優選所述MGB探針上標記的熒光基團選自FAM；所述EFTUD2內參基因MGB探針上標記的熒光基團選自HEX。

4.根據權利要求1-3中任意一項所述的引物探針，其特征在于，所述HER2基因引物的濃度為500nM，所述MGB探針的濃度為250nM，內參基因EFTUD2引物的濃度為500nM，所述內參基因MGB探針的濃度為250nM，配制成20×HER2引物探針預混液。

5.包含權利要求1-4中任意一項所述的用于檢測HER2拷貝數變異的引物探針的試劑盒。

6.一種采用權利要求5所述試劑盒進行HER2拷貝數變異的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將待測樣品進行DAN提取，獲得DNA提取物；

2)以所述待測樣品的DNA提取物作為待測模板，進行芯片式數字PCR擴增，獲得擴增產物進行分析，得到HER2基因拷貝數與EFTUD2基因拷貝數的比值。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述待測樣品為FFPE組織或血漿樣本。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系包括：待測DNA模板15-100ng；10×dPCR?Mix?2μL；20×HER2引物探針預混液Mix?1μL；用無核酸的ddH₂O補足至20μL；所述引物探針預混液是由終濃度為500nM的HER2基因引物，終濃度為250nM的探針，終濃度為500nM的內參基因EFTUD2引物，終濃度為250nM的內參基因探針配制而成。

9.根據權利要求6-8中任意一項所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為：95℃預變性5min；進行40個循環的95℃變性30sec，56℃退火45sec；20℃保存。

10.根據權利要求7-9中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟2)中，對于FFPE樣本：當HER2基因與內參基因的比值大于1.8時，HER2基因有擴增；當HER2基因與內參基因的比值小于或等于1.8時，HER2基因無擴增；

對于血漿樣本：當HER2基因與內參基因的比值大于1.3時，HER2基因有擴增；當HER2基因與內參基因的比值小于或等于1.3時，HER2基因無擴增。

11.權利要求1-4任意一項所述引物探針及權利要求5所述試劑盒在制備HER2拷貝數變異檢測系統、腫瘤診斷體系、腫瘤用藥評價體系中的應用。