[發明專利]檢測(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其應用

在審

• 申請號: 202310062031.9
• 申請日: 2023-01-16
• 公開（公告）號: CN115840038A
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 杜京堯;王新明;吳文娟;李博
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/577;G01N1/28
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及體外診斷技術領域，尤其涉及檢測(1?3)?β?D?葡聚糖含量的方法及其應用。本發明提供的檢測方法包括對樣本進行酶解處理、酸解處理和中和處理后，再利用抗BG的單克隆抗體建立的ELISA免疫檢測方法檢測樣本中(1?3)?β?D?葡聚糖的含量。該方法操作簡單且靈敏度與鱟試劑相當，與全自動化學發光儀儀器配合使用，可實現對樣本的隨機自動化檢測，具有操作簡單、快速、準確的優點。

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域，尤其涉及檢測(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其應用。

背景技術

β-D-葡聚糖(BG)是由多個葡萄糖分子通過β鍵結合的葡萄糖聚合物。葡萄糖的1位碳原子可與另一個葡萄糖的5個碳原子中的每一個結合，即1位碳原子、2位碳原子、3位碳原子、4位碳原子和6位碳原子。據報道，1位和3位(1→3)、1位和4位(1→4)或1位和6位(1→6)的結合組合經常出現在天然β-D-葡聚糖中。β-D-葡聚糖是真菌的細胞壁組成成分，是區別于其他微生物(如細菌)的特征性物質。由于此特征，β-D-葡聚糖分析法已用于深部真菌病的檢測。深部真菌病是一種機會性感染，患者由于抵抗力減弱而導致免疫功能失調，患者陷入極為危急的狀態。深部真菌病的典型致病真菌的實例包括念珠菌屬(Candida)和真菌屬(Aspergillus)。由于存在(1-3)-β-D-葡聚糖(BG)是這些致病生物的細胞壁所共有的，因此測量體液中的BG已用于深部真菌病感染的輔助診斷。

目前，檢測深部真菌病主要利用鱟(Limulus)試劑對BG的保護反應。該鱟試劑被批準用作體外診斷。但是，使用這種鱟試劑的方法需要天然資源鱟的血液，因此除了生態資源枯竭的問題之外，維持特定品質的成本也很高。該方法的另一個缺點是由于該技術需要多個步驟，因此易于發生分散。

對于侵襲性真菌病的診斷，需要在樣本中對BG進行敏感、特異的檢測。因此一種簡單、高效的檢測方法可以用來監測侵襲性真菌病的治療效果。化學發光法靈敏度高，線性范圍寬，特異性高，操作快速簡便，易于自動化，不存在環境污染等優點。化學發光技術依據其反應載體不同分為兩種：一種基于微孔板反應的半自動化學發光技術，另一種基于磁微粒反應的全自動化學發光技術，更趨均相、更加快速、更易于自動化。目前國產的大部分產品為前者。國際主流的大型診斷公司，大多數采取基于磁微粒反應的化學發光技術。磁微粒化學發光檢測技術必將成為檢測方法的主要發展方向之一，成為BG血清學檢測的主流技術，廣泛用于真菌病等侵襲性真菌疾病的篩查與診斷。

磁微粒化學發光技術應用于侵襲性真菌病檢測方面，具有高靈敏度、快速、準確、重復性好、線性范圍寬、安全無毒、無放射性污染等優點，易于實現自動化檢測，同時可以進一步縮短檢測時間，適宜于急診檢測。但該方法在檢測過程中容易受樣品中生物素的干擾，降低BG的檢測準確度。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種檢測(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其應用。本發明提供的檢測樣本中(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法包括先將樣本用酶解溶液酶解處理，再用酸解溶液酸解處理，最后用中和溶液中和處理后，用抗BG的單克隆抗體進行免疫檢測，能夠提高待測樣本的BG檢出率。

本發明提供了一種免疫檢測的預處理試劑，包括酶解溶液、酸解溶液和中和溶液；

所述酶解溶液中的酶為蛋白酶K、細胞壁裂解酶、蝸牛酶、蛋白水解酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、幾丁質酶、酰胺水解酶中的任意一種或多種；

所述酸解溶液中的酸為氨基磺酸、鹽酸、硝酸或硫酸中的任意一種或多種；

所述中和溶液為磷酸鹽溶液、碳酸鹽溶液或Tris-HCl緩沖液和表面活性劑中的任意一種或多種。