[發明專利]一種糖尿病腎病預測模型的建構、判斷方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202310048915.9
• 申請日: 2023-02-01
• 公開（公告）號: CN116487052A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 徐延勇;吳慧娟;張志剛;石佼玉;徐旭東;賀海東;胡屏
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G16H50/50
• 分類號: G16H50/50;G01N33/533;G16H50/20;G16H50/80
• 代理公司: 上海恒慧知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 31317
• 代理人: 張革

一種糖尿病腎病預測模型的建構、判斷方法及其試劑盒，其步驟包括：采集樣本；進行第一清洗步驟，將樣本利用第一洗劑進行清洗；對已進行第一清洗步驟的樣本進行免疫熒光標記；進行第二清洗步驟，將已進行免疫熒光標記的樣本利用第二洗劑進行清洗；以及成像步驟，對已清洗的免疫熒光標記的樣本進行成像以得到相應的圖像，由圖像計算樣本中的目標物的數量。一種應用于糖尿病腎病預測模型的試劑盒，試劑盒包括清洗樣本的第一洗劑及第二洗劑以及對所述樣本進行免疫熒光標記的一級抗體及二級抗體，試劑盒通過計數在樣本中于成像后的目標物數量，以判斷糖尿病腎病預測模型是否建構成功。

技術領域

本發明主要涉及一種疾病的預測模型建構及判斷的技術領域，具體的是準確計數預測模型中的腎小球足細胞的丟失數量，以判斷糖尿病腎病發展情況，并提供一種糖尿病腎病預測模型構建的試劑盒。

背景技術

足細胞是附著在腎小球基底膜(GBM)外側的臟層上皮細胞，其是無法被替換或再生的終末分化細胞，與基底膜和腎小球內皮細胞一起構成腎小球濾過屏障(GFB)。

足細胞是腎小球濾過屏障包括：機械屏障和電荷屏障的重要組成部分，參與合成腎小球基底膜的基質成分，并影響濾過膜靜水壓力，從而維持腎小球基底膜的代謝平衡。因此，足細胞在腎小球濾過屏障中起關鍵作用。當足細胞受到損傷時，例如足細胞丟失或結構改變，會破壞腎小球濾過屏障的完整性，導致蛋白滲漏，蛋白尿發生。

足細胞病是一種損傷足細胞的慢性腎臟疾病，以蛋白尿或腎病綜合征為主要臨床表現。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴重微血管并發癥，也是終末期腎病(ESRD)的最常見原因，蛋白尿是其最重要的臨床癥狀之一。在糖尿病患者中，代謝紊亂和血流動力學異常會導致足細胞損傷，因此，糖尿病腎病是最常見的足細胞病之一。隨著足細胞數量的減少，剩余的足細胞代償性肥大以覆蓋增加的腎小球基底膜，肥大足細胞中增寬的足突以及后期失代償所致基膜裸露均會導致持續性的大量蛋白尿。

在DN患者中，蛋白尿可引起水腫和低蛋白血癥，還可直接引起腎小管上皮細胞的壞死和脫落，是終末期腎病的重要危險因素。因此，足細胞數量可影響DN的發展和預后，計算足細胞數量變化對于足細胞病病程的判斷具有重要意義。

評估足細胞丟失常用的方法是對組織切片中每個腎小球橫截面的足細胞核進行計數。新近研究明確指出了這種方法的多重局限性，包括低保真度和準確性。鑒于此，一些學者開發了一種通過厚薄切片計數足細胞的方法。雖然這種方法提高了計數的準確性，但整個操作過程相當復雜；而且，這種方法的要求很嚴格，如切片過程中出現組織損失或切片位置偏移將不可避免地導致最終結果出現巨大誤差。

發明內容

本發明的主要目的是利用三維透明化技術由動物的腎小球足細胞的丟失數量來建構預測模型，用以判斷糖尿病腎病預測模型是否構建成功，以及判斷糖尿病腎病發展情況。

本發明的再一目的是利用三維透明技術應用于樣本中熒光蛋白或免疫染色樣本組織的多色成像以計數樣本中足細胞的數量來判斷糖尿病腎病預測模型是否構建成功，以及判斷糖尿病腎病發展情況。

本發明的另一目的在于提供一種試劑盒可以用于處理樣本組織并利用三維透明化技術及免疫熒光標記以計數樣本的足細胞數量以提高計數足細胞的數量準確度及判斷糖尿病腎病預測模型是否構建成功。

根據上述目的，本發明披露一種糖尿病腎病預測模型的構建、判斷方法，其步驟包括：采集樣本；進行第一清洗步驟，將樣本利用第一洗劑進行清洗；對已進行第一清洗步驟的樣本進行免疫熒光標記；進行第二清洗步驟，將已進行免疫熒光標記的樣本利用第二洗劑進行清洗；以及成像步驟，對已清洗的免疫熒光標記的樣本進行成像以得到相應的圖像，由圖像計算樣本中的目標物的數量。

在本發明較優選的實施例中，第一清洗步驟包括：將樣本浸入1/2第一洗劑中，振蕩6小時；將浸有樣本的1/2第一洗劑倒掉，添加新的第一洗劑并進行振蕩，接著于所述振蕩步驟之后更換新的第一洗劑；然后以48小時的時間為間隔更換浸有樣本的第一洗劑3次。