[發明專利]大腸桿菌及其在催化合成阿洛酮糖中的應用

有效

• 申請號: 202310044441.0
• 申請日: 2023-01-30
• 公開（公告）號: CN116042684B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 張志乾;賴詩靜;吳奕瑞;江翱;崔華;鄭曉茂;譚洪群;許波;吳嵩
• 申請（專利權）人: 態創生物科技（廣州）有限公司;廣州市乾相生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/52;C12N15/61;C12N1/21;C12N1/36;C12N13/00;C12N15/01;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 項麗

1.一種CRISPR質粒A，其特征在于所述CRISPR質粒A包含crRNA、LE、RE、cfa、ibpA和ibpB基因，所述crRNA靶向FruA。

2.根據權利要求1所述的CRISPR質粒A，其特征在于該質粒的序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.一種轉座酶體系，其特征在于：包括權利要求1或2所述的CRISPR質粒A，以及轉座酶質粒；

所述轉座酶質粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的編碼基因。

4.根據權利要求3所述的轉座酶體系，其特征在于：轉座酶質粒的序列如SEQ?ID:No.1所示。

5.一種CRISPR質粒B，其特征在于所述CRISPR質粒B包含crRNA、LE、RE、DPEase重組基因，其中DPEase重組基因的核苷酸序列見SEQ?ID?NO:7。

6.根據權利要求5所述的CRISPR質粒B，其特征在于其序列如SEQ?ID:No.5所示。

7.一種用于阿洛酮糖生物合成的大腸桿菌，其特征在于，敲除大腸桿菌的FruA基因，在大腸桿菌的基因組上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重組基因，使得DPEase蛋白產物錨定在大腸桿菌細胞表面。

8.根據權利要求7所述的大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌經誘變和高溫度培養條件下馴化處理。

9.根據權利要求8所述的大腸桿菌，其特征在于誘變的方式為等離子誘變、微波誘變、電離輻射誘變、紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變中的一種或者多種組合；

馴化的方式是將誘變后的菌株在更高溫度的培養環境中培養，選擇其中生長速度最快的菌株，再誘變，再置于更高溫度的培養環境中培養，重復誘變-培養的過程，直至誘變后的菌株在目標溫度的培養環境下的生長速度基本達到或超過誘變前正常環境的生長速度。

10.權利要求7-9中任一項所述的大腸桿菌在催化合成阿洛酮糖中的應用。

11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于反應底物為果糖。

12.權利要求7-9中任一項所述的大腸桿菌的制備方法，其特征在于其步驟包括：

(1)敲除大腸桿菌的FruA基因，并插入cfa、ibpA和ibpB基因；

(2)將大腸桿菌進行誘變，并在37-55℃培養條件下梯度升溫馴化；

(3)在大腸桿菌的基因組中插入阿洛酮糖異構酶DPEase重組基因，將DPEase蛋白產物錨定在大腸桿菌細胞表面。

13.根據權利要求12所述的大腸桿菌的制備方法，其特征在于步驟(1)通過權利要求3或4所述的轉座酶體系實現。

14.根據權利要求12所述的大腸桿菌的制備方法，其特征在于步驟(2)具體為將改造后的菌株誘變處理后，涂布在含果糖的無抗培養基，置于40-45℃培養箱中培養，直至長出單克隆；將長勢最快的1～4個單克隆挑取到無抗培養基中，震蕩培養一段時間后，誘變處理，然后涂布在含果糖的無抗培養基，提高培養溫度1-2℃培養，直至長出單克??；將長勢最快的1～4個單克隆挑取到無抗培養基中，重復上述誘變-培養的過程，每次培養溫度提升1-2℃，直至培養溫度達到50-55℃，選取長勢最快的單克隆，即為馴化后的菌株。

15.根據權利要求12所述的大腸桿菌的制備方法，其特征在于步驟(3)通過權利要求3或4所述的轉座酶質粒及權利要求5或6所述的CRISPR質粒B實現。