[發明專利]大腸桿菌及其在催化合成阿洛酮糖中的應用

有效

• 申請號: 202310044441.0
• 申請日: 2023-01-30
• 公開（公告）號: CN116042684B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 張志乾;賴詩靜;吳奕瑞;江翱;崔華;鄭曉茂;譚洪群;許波;吳嵩
• 申請（專利權）人: 態創生物科技（廣州）有限公司;廣州市乾相生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/52;C12N15/61;C12N1/21;C12N1/36;C12N13/00;C12N15/01;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 項麗

本發明公開了一種用于阿洛酮糖生物合成的大腸桿菌，敲除大腸桿菌的FruA基因，在大腸桿菌的基因組上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重組基因，使得DPEase蛋白產物錨定在大腸桿菌細胞表面。還公開了其制備方法、CRISPR質粒A和B以及相應的轉座酶體系。本發明敲除了大腸桿菌的FruA基因，降低了果糖的非目的性消耗。并插入cfa、pA和ibpB基因，然后對FruA缺失的大腸桿菌菌株進行了耐高溫和耐高果糖的馴化，以提高大腸桿菌宿主在催化環境(55℃)中的穩定性。利用酶錨定技術將阿洛酮糖異構酶錨定在大腸桿菌的表面，使得阿洛酮糖異構酶在大腸桿菌表面生長，并催化外界環境中的果糖轉化成阿洛酮糖。

技術領域

本發明涉及一種大腸桿菌及其在催化合成阿洛酮糖中的應用。

背景技術

阿洛酮糖(D-Psicose)屬于一種酮糖，是由D-果糖在C-3位置差相異構形成的一種重要稀有糖，有近似蔗糖的甜味，但與蔗糖相比，阿洛酮糖的熱量極低，被認為是食品的理想蔗糖替代品，可以用作食品和膳食補充劑中的成分。而阿洛酮糖在人體內經過腸道吸收后幾乎不發生代謝、不產生能量，且很少被腸道微生物發酵利用，此特性也是其作為替代型甜味劑的主要原因。不僅如此，阿洛酮糖可以通過抑制α-葡萄糖苷酶從而減少葡萄糖的吸收，可控制血糖濃度的升高。阿洛酮糖被認為是食品的理想蔗糖替代品，且它具有重要的生理功能，如血糖抑制作用，清除活性氧和神經保護作用。由于阿洛酮糖是一種罕見的糖，在自然界中純在的量非常的少。人們發現阿洛酮糖異構酶(D-Psicose-3-epimerase,DPEase)可以催化D-果糖異構化為稀有糖——阿洛酮糖。盡管在許多物種中發現能夠表達阿洛酮糖異構酶，但自然宿主中表達的阿洛酮糖異構酶蛋白量極低，無法產生阿洛酮糖。因此通過基因工程細菌在體外表達重組的阿洛酮糖異構酶蛋白，以提高阿洛酮糖的轉化率，成為阿洛酮糖生物合成領域的主流方法。但是，目前發現的阿洛酮糖異構酶都是嗜熱型蛋白，最適反應溫度在55-65℃，反應底物一般是500-700g/l的果糖。這種高溫高滲條件對酶以及其表達宿主的穩定性都是很大的挑戰。此外，果糖作為宿主可以利用的碳源之一，容易進入宿主細菌代謝，而不參與阿洛酮糖的合成。

發明內容

本發明主要目的是獲取一種大腸桿菌，可用于催化阿洛酮糖的合成。

本發明公開了一種CRISPR質粒A，所述CRISPR質粒A包含crRNA、LE、RE、cfa、ibpA和ibpB基因，所述crRNA靶向FruA。

優選的，該質粒的序列如SEQ?ID?NO:2所示。

本發明還公開了一種轉座酶體系，包括上述的CRISPR質粒A，以及轉座酶質粒；

所述轉座酶質粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的編碼基因。

優選的，轉座酶質粒的序列如SEQ?ID:No.1所示。

本發明還公開了一種CRISPR質粒B，所述CRISPR質粒B包含crRNA、LE、RE、DPEase重組基因，其中DPEase重組基因的核苷酸序列見SEQ?ID?NO:7。

優選的，其序列如SEQ?ID:No.5所示。

本發明還公開了一種用于阿洛酮糖生物合成的大腸桿菌，敲除大腸桿菌的FruA基因，在大腸桿菌的基因組上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重組基因，使得DPEase蛋白產物錨定在大腸桿菌細胞表面。

優選的，所述大腸桿菌經誘變和高溫度培養條件下馴化處理。

優選的，誘變的方式為等離子誘變、微波誘變、電離輻射誘變、紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變中的一種或者多種組合；