[發明專利]一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase M15、其基因及制備方法和應用

在審

• 申請號: 202310027094.0
• 申請日: 2023-01-09
• 公開（公告）號: CN115948377A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 王麗麗;劉森;徐永平;李曉宇;任媛;李根
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;A01N63/50;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 潘小鐵;劉琦

本發明提供一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15，其氨基酸序列如SEQ?IDNo.3所示，核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發明還公開了所述的裂解酶peptidase?M15制備方法，通過大腸桿菌原核表達系統表達并純化的裂解酶peptidaseM15同時具有裂解宿主譜廣以及高效抗菌作用的優點，在針對水產以及公共衛生領域抗生素耐藥的副溶血弧菌感染方面有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于重組DNA生物技術領域，具體涉及一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase?M15、其基因及制備方法和應用。

背景技術

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，廣泛分布在海水、淤泥以及魚蝦貝類等水產動物體內，能引起蝦紅體病、魚類皮膚潰爛等水產動物疾病，是水產養殖業的主要致病菌之一。同時副溶血弧菌還可以導致包括傷口感染、敗血癥或更常見的急性胃腸炎等多種人類疾病。由于抗生素耐藥性問題愈發嚴重，大多數抗生素將逐漸失去作用，與此同時，新型抗生素的開發速度較為緩慢，亟需研制一種從生物安全性角度出發的有效抗菌藥物。

噬菌體是一類專門侵染細菌的病毒，英文名為bacteriophage，由Twort和Felixd’Herelle于1917年所發現。噬菌體以細菌為宿主，并在細菌體內進行復制和增值。在感染細菌的末期，裂解性噬菌體釋放細胞壁水解酶，從而釋放出子代噬菌體顆粒，并導致細菌的裂解和死亡。

目前噬菌體應用于食品、水產養殖、畜禽、疾病防控等多個領域來控制耐藥性病原菌的感染。然而噬菌體的應用具有頗多的局限性，如噬菌體裂解譜較窄，多數噬菌體僅能特異性裂解一種宿主菌；易產生抗性等，因此克服這些局限性成為噬菌體應用首要解決的問題。噬菌體所表達的細胞壁水解酶又稱為裂解酶，它具有高特異性、快速起作用、高效率和低耐藥風險等特點，能從水解細菌病原體肽多糖進而殺滅細菌，被認為是后抗生素時代抗生素的替代治療劑。然而，目前一些研究報道的噬菌體裂解酶，如Lysin1902需要在外源添加劑的作用下才能發揮抗菌作用(王瑜欣等.噬菌體裂解酶Lysin1902原核表達及其與ε-聚賴氨酸聯用效果評價[J/OL].微生物學報)，因此，擺脫外源添加劑的輔助，研制具有獨立抗菌活性的裂解酶，成為抗生素替代領域需要重點關注的問題之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種源于副溶血弧菌噬菌體編碼的裂解酶基因以及體外制備方法。

本發明的技術方法如下：

一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase?M15，所述副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase?M15的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

一種編碼所述副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase?M15的基因，原始核苷酸序列如SEQ?ID?No.1，經過大腸桿菌遺傳密碼偏好性進行優化，優化后的編碼裂解酶的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，即為所述副溶血弧菌裂解酶的編碼基因。

一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase?M15的制備方法，通過下述方案實現：

S1對副溶血噬菌體vB_VpaM_VPs20所編碼的裂解酶的如SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列進行大腸桿菌遺傳密碼子優化，優化后的裂解酶的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，即為所述副溶血弧菌裂解酶的編碼基因；

S2通過人工合成目的基因進行重組表達載體pCzn1-M15的構建，對重組大腸桿菌Arctic?Express-m15的篩選鑒定；

S3對重組大腸桿菌Arctic?Express-M15的誘導表達條件進行優化，并對產生的包涵體進行復性后通過Ni柱純化獲得大量正確折疊的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?IDNo.3所示。

所述重組表達載體的NdeI和XbaI酶切位點中間插入含有SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列。所述重組表達載體為原核低溫(11℃-37℃)誘導表達載體，具體名稱為pCzn1-M15質粒。