[發(fā)明專利]一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidase M15、其基因及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310027094.0
• 申請(qǐng)日: 2023-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115948377A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王麗麗;劉森;徐永平;李曉宇;任媛;李根
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;A01N63/50;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 大連格智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 潘小鐵;劉琦

1.一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15，其特征在于，所述副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

2.一種編碼權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的基因，其特征在于：原始核苷酸序列如SEQ?ID?No.1，經(jīng)過(guò)大腸桿菌遺傳密碼偏好性進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的編碼裂解酶的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，即為所述副溶血弧菌裂解酶的編碼基因。

3.一種權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1對(duì)副溶血噬菌體vB_VpaM_VPs20所編碼的裂解酶如SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列進(jìn)行大腸桿菌遺傳密碼子偏好性優(yōu)化，優(yōu)化后的裂解酶的核苷酸序列如SEQ?IDNo.2所示，即為所述副溶血弧菌裂解酶的編碼基因；

S2通過(guò)人工合成目的基因進(jìn)行重組表達(dá)載體pCzn1-M15的構(gòu)建，對(duì)重組大腸桿菌ArcticExpress-M15的篩選鑒定；

S3對(duì)重組大腸桿菌ArcticExpress-m15的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)產(chǎn)生的包涵體進(jìn)行復(fù)性后通過(guò)Ni柱純化獲得大量正確折疊的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?IDNo.3所示。

4.如權(quán)利要求3所述的一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的制備方法，其特征在于：所述重組表達(dá)載體的NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)中間插入含有SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列；所述重組表達(dá)載體為原核低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體，具體名稱為pCzn1-M15質(zhì)粒。

5.如權(quán)利要求3所述的一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的制備方法，其特征在于：大腸桿菌ArcticExpress為宿主菌，含有所述SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列的重組載體。

6.如權(quán)利要求3所述的一種副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15的制備方法，其特征在于：具體包括如下步驟：

S1、重組表達(dá)載體pCzn1-M15構(gòu)建：

將噬菌體裂解酶原始核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，參考大腸桿菌遺傳密碼子偏好性表對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的裂解酶的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，使其更利于在宿主菌中的表達(dá)，但其編碼氨基酸序列不變，然后通過(guò)人工合成基因?qū)⑵淇寺〉絧Czn1質(zhì)粒的NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pCzn1-M15質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌T1菌株中作為克隆菌株保存質(zhì)粒；

S2、重組大腸桿菌ArcticExpress-M15表達(dá)菌株構(gòu)建：

從帶有pCzn1-M15質(zhì)粒的大腸桿菌T1菌株中提取質(zhì)粒，通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法取1μL濃度為80-100ng/mL的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ArcticExpress感受態(tài)細(xì)胞，并用含有Amp抗性培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌株，傳代培養(yǎng)兩代，直至菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定，獲得重組大腸桿菌Arctic?Express-M15；

S3、重組M15蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：

對(duì)重組大腸桿菌ArcticExpress-M15菌株進(jìn)行發(fā)酵液體培養(yǎng)，在菌體OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為0.2mM，15℃220r/min振搖過(guò)夜，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；將菌體沉淀重懸于20mL裂解液，超聲破碎后用包涵體洗滌液進(jìn)行處理，得到復(fù)性的可溶性蛋白后再通過(guò)Ni柱親和純化。

7.一種權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌噬菌體裂解酶peptidaseM15在裂解副溶血弧菌中的應(yīng)用。