[發明專利]非洲豬瘟病毒免疫原的p49突變融合蛋白、重組載體、工程菌及制備方法和應用

在審

• 申請號: 202310019787.5
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN116217737A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 張強;錢泓;吳有強;徐玉蘭;姜冰潔;賈寶琴
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明公開了非洲豬瘟病毒免疫原的p49突變融合蛋白、重組載體、工程菌及制備方法和應用，所述制備方法包括：1)將含有TrxA?p49融合蛋白的編碼基因克隆至原核表達載體中，得到含有TrxA?p49融合蛋白的編碼基因的重組質粒，所述p49為p49突變蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示；2)再將步驟1)中的所述重組質粒轉化至大腸桿菌細胞中，得到重組表達TrxA?p49的菌株；3)通過培養、篩選、步驟2)中所述重組表達TrxA?p49的菌株，得到高度表達的菌株；以及4)發酵培養步驟3)中所述高度表達的菌株，純化后得到重組可溶性表達TrxA?p49融合蛋白。本發明克服了現有技術中的缺陷，解決了大腸桿菌中不能直接大量可溶性表達P49蛋白且產量低的問題。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域。涉及一種非洲豬瘟P49蛋白制備方法和應用。

背景技術

非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African?swine?fevervirus，ASFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，發病率及死亡率高達100％。豬感染非洲豬瘟病毒后出現皮膚充血，內臟器官出血，高熱為特征臨床癥狀，豬是ASFV自然感染的唯一哺乳動物宿主，包括家豬和野豬，尤其是家豬，易感性極高，對畜牧業影響巨大。世界動物衛生組織將其列為A類疫病，我國也將其列為一類動物傳染病。

該病最早在1921年于非洲的肯尼亞國家確認發生，對非洲乃至全球多個國家的養豬業造成極大打擊。雖然，國內外學者對非洲豬瘟做了大量的研究工作，但研究發現：常規制備的非洲豬瘟滅活苗效果不明顯，而弱毒苗保護效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效預防非洲豬瘟的疫苗和治療該病的藥物發現，迫切需要新型疫苗的研發和生產來預防非洲豬瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的蟲媒DNA病毒。病毒顆粒呈二十面體對稱結構，平均直徑200nm，表面有含糖脂類的囊膜覆蓋。其病毒基因組為雙股線性DNA，大小為170-190kb，整個基因組大約有150個ORF，編碼150-200中蛋白質。P49(PB438L)蛋白由PB438L基因編碼的病毒衣殼蛋白。由438個氨基酸組成，分子量大小約為49.3kDa。目前研究報道該蛋白不參與ASFV感染早期與宿主細胞膜的相互作用，主要參與病毒后期的組裝過程，該蛋白主要定位于病毒顆粒組裝位點，參與細胞膜的形成，指導ASFV病毒粒子組裝成整二十面體結構，所以該蛋白可能是一個良好的疫苗候選抗原。在當前沒有可能大規模制備滅活疫苗或弱毒疫苗的情況下，確定一種制備該病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一種能夠預防該疾病的疫苗或具有能夠預防該疾病的亞單位蛋白具有重大的意義。

發明內容

在現有技術的基礎上，本發明為了克服現有技術中存在的諸多缺陷(如表達產量低，包涵體表達，純化困難成本相對較高等)，提供了一種制作成本低廉可在大腸桿菌中直接可溶性表達p49的核苷酸序列及蛋白制備方法。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種可在大腸桿菌中表達p49蛋白的優化后的OPTI-p49的核苷酸序列。為了能夠在大腸桿菌中高效表達p49蛋白，本發明根據GenBank:FR682468.1(毒株：Georgia?2007/1)上已經存在公開的序列，我們對p49基因進行分析，首先對p49基因編碼的密碼子的在原核表達中的密碼子偏好性、GC含量和mRNA在大腸桿菌的穩定性進行了優化，其次對p49基因可能影響可溶性表達第40個氨基酸C突變成S，即C40S。也就是說，所述p49突變蛋白為p49氨基酸序列中第40位的半胱氨酸(C)突變為絲氨酸(S)的突變蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。所述最終優化后OPTI-p49的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?3所示。