[發明專利]一種藥用級間充質干細胞及其培養方法

在審

• 申請號: 202310019762.5
• 申請日: 2023-01-06
• 公開（公告）號: CN115960824A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 王穎;曹毓琳;趙鵬偉;李偉
• 申請（專利權）人: 唐頤控股（深圳）有限公司;上海唐頤惠科生物工程設備有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12Q3/00;C12M1/02;C12M1/04;C12M1/34;C12M1/36;C12M1/38;C12M3/00;C12M1/00
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 施青青

本申請涉及細胞擴增培養的技術領域，具體公開了一種藥用級間充質干細胞及其培養方法，該培養方法包括：將密度為（4?6）×10⁴個/mL間充質干細胞接種于裝有溶脹完全的微載體的生物反應器中，設置生物反應器工藝控制參數，包括溫度37℃，pH?7.2?7.4，溶氧濃度20?30%以及采用間歇式攪拌方式和持續性攪拌方式結合的攪拌方式，擴增培養，制得藥用級間充質干細胞。本申請的培養方法可在不同規模生物反應器中運行穩定，且能夠有效擴增間充質干細胞，細胞活率達到90%以上，并符合藥用級的標準，可應用于相關的研究及臨床治療中。

技術領域

本申請涉及細胞擴增培養的技術領域，更具體地說，涉及一種藥用級間充質干細胞及其培養方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal?Stem/Stromal?cell，MSCs)是一種具有自我更新能力、且具有多向分化潛能的原始細胞，來源于發育早期的中胚層。研究表明，間充質干細胞可從骨髓、臍帶、臍血、胎盤以及脂肪等組織中提取獲得。通過體外擴增培養，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞以及成脂肪細胞等多種細胞，是組織工程和干細胞治療的理想種子細胞。臨床上的應用包括：改善骨關節炎預后、治療心梗、修復肺損傷、治療神經系統疾病和改善高血糖等。

因此，在體外對間充質干細胞進行大規模培養以獲得足夠數量且高質量的細胞，對于滿足臨床方面的需求具有重要的意義。傳統的體外培養方法主要為2D培養，即使用培養瓶進行培養，細胞貼壁的面積僅為培養瓶的內壁所提供的面積，可供細胞貼壁的面積較小，故在細胞的培養過程中，往往需要消耗的培養瓶數量多、占地面積大，并且需要眾多的人力物力，操作繁瑣，污染風險大，并且難以保證細胞的一致性及細胞質量。

間充質干細胞呈纖維狀，具有貼壁生長的特性。微載體是一種的球體，能夠提供較高的比表面積。利用生物反應器進行大規模細胞培養的過程中，通過使用微載體提供貼壁表面，可以改善上述狀況。當微載體的使用濃度為10g/L時，可以為1cm³的培養液提供30cm²的生長表面積，從而獲得更高的細胞密度。有文獻報道，使用微載體在攪拌式生物反應器中培養MSCs?12天，細胞密度最高可達1.7×10⁵個/mL，細胞數量可擴增6倍以上，相當于65個T175培養瓶平面培養獲得的細胞。

細胞體外大規模擴增培養需要營養均一和條件可控的生長環境。目前，應用較為廣泛的生物反應器包括攪拌罐式生物反應器、波浪式生物反應器、中空纖維式生物反應器和固定床生物反應器。攪拌罐式反應器可以充分傳質、傳熱，使培養液營養成分分布均勻，能夠進行過程控制與監測。除了溫度(T)、溶解氧(DO)、pH和攪拌速度等控制參數外，使用生物反應器還具有附加的稱重功能，還可以使用反應器自帶的蠕動泵進行料液轉移等操作。這些功能都能促使規模化細胞培養的操作簡化，也可以按照需求更改培養工藝。

采用傳統的細胞體外大規模擴增培養技術，可以在短期內獲得大量的細胞，但不同生產批次細胞的生理代謝水平存在一定的差異，且難以滿足藥用級細胞的要求，無法直接在臨床上應用。

發明內容

為了在短期內獲得大量符合藥用級要求的間充質干細胞，本申請提供一種藥用級間充質干細胞的培養方法及其應用。本申請通過微載體和生物反應器的結合利用，為細胞提供了類似于人體內的生長環境，可以在維持細胞生長速度的同時保證細胞的表型及分化功能正常；進一步對培養過程中的參數進行優化，獲得的間充質干細胞可以達到藥用級，能夠安全地應用于臨床的研究及治療中。

第一方面，本申請提供一種藥用級間充質干細胞的培養方法，采用如下的技術方案：

將密度為(4-6)×10⁴個/mL的間充質干細胞接種于裝有溶脹完全的微載體的生物反應器中，設置生物反應器工藝控制參數，包括溫度37℃，pH?7.2-7.4，溶氧濃度20-30％以及采用間歇式攪拌方式和持續性攪拌方式結合的攪拌方式，擴增培養，制得藥用級間充質干細胞；