[發明專利]一種人乳頭瘤病毒56型L1蛋白突變體及減少重組蛋白降解的方法及應用

有效

• 申請號: 202310019679.8
• 申請日: 2023-01-06
• 公開（公告）號: CN116375816B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發明（設計）人: 陳曉;伍樹明;劉永江;銀飛;張海江;姜旭林;張瑞霞;薛俊蓮;王學紅;沈邇萃
• 申請（專利權）人: 北京康樂衛士生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K14/025
• 分類號: C07K14/025;C12N15/37;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明涉及醫藥生物領域，公開一種人乳頭瘤病毒56型L1蛋白突變體及其減少重組人乳頭瘤病毒56型L1蛋白降解的方法及應用。本發明采用基因工程技術對HPV56L1氨基酸序列的第420位R突變為T或Q的改造成功解決了其降解的問題。實驗表明，所做突變均不影響對應突變后L1蛋白的表達，且改造后VLP蛋白的降解比例明顯減少，也不影響對應VLP的免疫原性。因此，本發明通過對人乳頭瘤病毒56型L1蛋白突變改造后避免了其降解問題，降低了制造難度，改善了質量性狀，使得重組表達改造后序列并組裝所獲對應HPV56L1?VLP更適合作為預防該型乳頭瘤病毒感染的疫苗抗原蛋白。

技術領域

本發明涉及醫藥生物領域，具體涉及人乳頭瘤病毒L1蛋白的表達方法。更具體涉及人乳頭瘤病毒56型L1蛋白突變體及其減少重組人乳頭瘤病毒56型L1蛋白降解的方法及應用。

背景技術

人乳頭瘤病毒(Human?Papillomavirus，HPV)是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，其通過黏膜和皮膚微創感染上皮組織基底層細胞，引起上皮組織的良性或惡性增生性病變。高危型HPV的慢性持續性感染是誘發宮頸癌的主要病因。目前超過200多種HPV亞型被鑒定出來(http://www.hpvcenter.se/html/refclones.html)。根據世界衛生組織(WHO)發布的人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告(全球)和人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告(中國)，目前確定與誘發宮頸癌相關的HPV高危型主要有以下13個：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68。

HPV的衣殼是一個由結構蛋白L1和L2組成的正二十面體，直徑約55nm。目前利用真核細胞，酵母或大腸桿菌均有報道可有效表達L1蛋白，且在沒有L2參與下72個L1五聚體蛋白可自組裝(self-assembly)形成病毒樣顆粒(Virus-like?Particles，VLPs)。將前述VLPs作為抗原免疫后可誘導機體產生型別特異性中和抗體，有效保護機體免受同型別病毒的感染，這是目前宮頸癌預防疫苗開發的主要策略，且國內已有4款上市品種(Cervarix，Gardasil，Gardasil?9，Cecolin)。

HPV56型屬于Alphapapillomavirus?6分支，為高危型之一。根據WHO發布的人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告(全球和中國)，全球宮頸癌檢測病例中HPV56亞型的檢出率接近1％，中國接近1.1％。目前已上市疫苗品種中均未包含該型別。HPV56L1全長蛋白含499個氨基酸(GenBank:ALT54864.1)，經https://web.expasy.org/compute_pi/網站在線預測其理論pI和分子量分別為：8.75和56059.52Da。

因此有必要進行重組表達HPV56L1蛋白并將其開發成為病毒樣顆粒(VLP)疫苗的研究工作。

發明內容

基于大腸桿菌表達體系的HPV56L1工程菌在表達純化過程中目的蛋白HPV56L1表現出了明顯的降解情況。該型L1蛋白的降解一方面影響著L1五聚體組裝成VLP的過程(降解比例大，組裝后VLP粒徑偏小)，另一方面影響了該型的樣品質量，進而會影響多價疫苗作為疫苗總體的質量水平。L1蛋白降解導致其組裝形成的病毒樣顆粒免疫原性下降，降低了其作為疫苗有效成分用于預防病毒感染的藥效。本發明人開展了HPV56L1降解問題的重點攻關工作。我們通過全面細致的質譜檢測分析研究(具體研究內容包括全長及降解L1蛋白電泳條帶膠內酶解，N/C端測序，氨基酸覆蓋率及肽段豐度對比分析等)，結果發現：HPV56L1蛋白的降解位點為420位的精氨酸(R)。結構模擬分析顯示R420位于L1五聚體結構的表面。精氨酸是胰蛋白酶的水解位點，胰蛋白酶特異性作用于堿性氨基酸精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵，且特異性很強。因此我們的研究表明在重組蛋白表達過程中，HPV56L1蛋白在胰蛋白酶的作用下容易在420位精氨酸的羧基端產生酶解斷裂。