[發明專利]桔小實蠅嗅覺受體OR43a-1和OR63a-2的應用及其突變體的構建方法

在審

• 申請號: 202310017583.8
• 申請日: 2023-01-06
• 公開（公告）號: CN116411028A
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 蔣紅波;徐麗;余捷玲;王進軍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/033;C12N15/12
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務所(普通合伙) 50241
• 代理人: 顧曉玲

本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，公開了桔小實蠅嗅覺受體或受體基因BdorOR43a?1或/和BdorOR63a?2作為靶標在以下任一中的應用：(1)調控桔小實蠅的行為；(2)制備桔小實蠅行為調節劑；(3)制備桔小實蠅雌蟲引誘劑或雌蟲產卵引誘劑；(4)調控桔小實蠅對刺激氣味分子的敏感性。還公開了一種調控桔小實蠅對苯并噻唑的敏感性的基因編輯方法和桔小實蠅嗅覺受體基因突變體的構建方法。本發明揭示了桔小實蠅感受產卵引誘物質苯并噻唑的關鍵嗅覺受體OR43a?1和OR63a?2，為開發桔小實蠅新型高效雌蟲引誘劑提供可靠分子靶標。

技術領域

本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，具體涉及桔小實蠅嗅覺受體OR43a-1和OR63a-2的應用及其突變體的構建方法。

背景技術

桔小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)是一種世界范圍內分布的危險性害蟲，可危害多種果樹的果實。除柑桔外，還能為害芒果、番石榴、番荔枝、楊桃、枇杷等。成蟲產卵于寄主果實，幼蟲在果實中取食果肉并發育成長，幼蟲成熟后從果實中跳出并入土化蛹，成蟲在土壤中羽化。果實受桔小實蠅幼蟲的危害后，可造成落果或使果實失去經濟價值，該蟲嚴重發生的地區可造成產量的巨大損失。由于其寄主范圍廣、入侵擴散能力強、抗藥性發展速度快等特點，加之其幼蟲在果實內取食危害的特性，對桔小實蠅的有效防控較為困難。目前，基于引誘劑的誘殺法是防治桔小實蠅最為有效的方法，特別在疫區對桔小實蠅種群動態監測、擴散前沿帶的快速撲滅等均依賴于誘劑的使用。其中，甲基丁香酚(Methyleugenol,ME)是目前常用商業化引誘劑的主要成分，其僅對實蠅類害蟲的雄蟲具有引誘力。然而在田間桔小實蠅一旦交配，防治雄蟲就無濟于事。

昆蟲嗅覺器官感知外界環境的刺激氣味之后，位于嗅覺感受器神經元的嗅覺受體(Odorant?Receptors,ORs)“編碼”外界氣味分子，將刺激物的化學信號轉化為電信號，最終傳遞至腦。目前，有多個研究團隊試圖對桔小實蠅嗅覺受體進行注釋，但往往受限于目前已公布基因組的質量。相比于模式昆蟲果蠅Drosophila?melanogaster，桔小實蠅嗅覺受體的研究較為緩慢，目前僅有少量嗅覺受體基因的功能的已驗證。例如，BdorOR13a參與感受1-辛烯-3-醇，BdorOR82a參與感受乙酸香葉酯(Miyazaki?et?al.,2018)，BdorOR88a參與感受甲基丁香酚(Liu?et?al.,2018)。

桔小實蠅主要通過交配后雌蟲產卵于寄主果實內部，卵孵化后幼蟲取食危害。產卵引誘劑能夠引誘交配后的雌蟲過去產卵。因此，發掘靶向雌蟲產卵的引誘劑，研發誘集雌蟲的方法，對桔小實蠅的防控更具有現實意義。芒果中的苯并噻唑(benzothiazole)對桔小實蠅具有強烈的產卵引誘力，且其對交配后的桔小實蠅引誘力更強，觸角電生理反應也更敏感，被認為是極具應用潛力的桔小實蠅產卵引誘物質。目前，為靶向關鍵嗅覺受體創制害蟲引誘劑，發掘重要化學信號物質的嗅覺受體已成為反向化學生態學的一個熱點領域。開發穩定高效、環境友好型的行為調控方法，已成為桔小實蠅防控新思路。

然而，桔小實蠅感受苯并噻唑的嗅覺受體及其結合的分子機制尚不清楚，嚴重制約了苯并噻唑在桔小實蠅產卵引誘劑研發中的應用。因此，挖掘桔小實蠅感受苯并噻唑的關鍵受體及其與苯并噻唑結合的關鍵位點，將為桔小實蠅新型雌蟲引誘劑研發提供極具潛力的分子靶標；獲得的關鍵受體結構及其與苯并噻唑結合能力相互關系的基礎數據，將為靶向關鍵嗅覺受體的桔小實蠅特異性引誘劑的改造、效力提升提供重要理論依據。

發明內容

本發明針對上述問題，綜合利用行為學觀察、qPCR、異源表達以及基于爪蟾卵母細胞表達系統的電壓鉗技術在離體水平挖掘可與苯并噻唑結合的關鍵嗅覺受體；利用基因編輯CRISPR/Cas9技術在活體水平探究該嗅覺受體的生理功能；利用蛋白三維結構模擬和分子對接技術揭示嗅覺受體與苯并噻唑結合的關鍵位點。基于此，本發明提供了如下技術方案：

本發明提供了桔小實蠅嗅覺受體BdorOR43a-1或/和BdorOR63a-2，或者桔小實蠅嗅覺受體基因BdorOR43a-1或/和BdorOR63a-2作為靶標在以下任一中的應用：