[發(fā)明專利]桔小實(shí)蠅嗅覺(jué)受體OR43a-1和OR63a-2的應(yīng)用及其突變體的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310017583.8
• 申請(qǐng)日: 2023-01-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116411028A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣紅波;徐麗;余捷玲;王進(jìn)軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;A01K67/033;C12N15/12
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50241
• 代理人: 顧曉玲

1.桔小實(shí)蠅嗅覺(jué)受體BdorOR43a-1或/和BdorOR63a-2，或者桔小實(shí)蠅嗅覺(jué)受體基因BdorOR43a-1或/和BdorOR63a-2作為靶標(biāo)在以下任一中的應(yīng)用：

(1)調(diào)控桔小實(shí)蠅的行為；

(2)制備桔小實(shí)蠅行為調(diào)節(jié)劑；

(3)制備桔小實(shí)蠅雌蟲(chóng)引誘劑或雌蟲(chóng)產(chǎn)卵引誘劑；

(4)調(diào)控桔小實(shí)蠅對(duì)刺激氣味分子的敏感性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：以BdorOR43a-1或/和BdorOR63a-2作為靶標(biāo)，調(diào)節(jié)桔小實(shí)蠅雌蟲(chóng)對(duì)刺激氣味分子的嗅覺(jué)敏感性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述刺激氣味分子為雌蟲(chóng)引誘劑或雌蟲(chóng)產(chǎn)卵引誘劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述刺激氣味分子為苯并噻唑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：BdorOR43a-1受體與苯并噻唑結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)是氨基酸SER69，BdorOR63a-2受體與苯并噻唑結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)是氨基酸TYR324。

6.一種調(diào)控桔小實(shí)蠅對(duì)苯并噻唑的敏感性的基因編輯方法，其特征在于：首先針對(duì)桔小實(shí)蠅BdorOR43a-1基因或者BdorOR63a-2基因設(shè)計(jì)gRNA，然后向桔小實(shí)蠅中注射入gRNA和Cas9蛋白的混合物進(jìn)行基因編輯；

對(duì)于BdorOR43a-1基因，gRNA在BdorOR43a-1基因E1外顯子的gRNA靶點(diǎn)的核苷酸序列為：CCTTGCTGCGTACGTGCCTTATT；

對(duì)于BdorOR63a-2基因，gRNA在BdorOR63a-2基因E3外顯子的gRNA靶點(diǎn)的核苷酸序列為：GAAAACTATGAACTACTGCAAGG。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：

將gRNA和Cas9蛋白的混合物注射入桔小實(shí)蠅新鮮胚胎中。

8.一種桔小實(shí)蠅嗅覺(jué)受體基因突變體的構(gòu)建方法，其特征在于：采用權(quán)利要求7所述的方法對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行基因編輯，然后將胚胎注射后存活至成蟲(chóng)的G₀代個(gè)體與野生型個(gè)體雜交、傳代，篩選突變體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述篩選突變體的具體方法為：

將胚胎注射后存活至成蟲(chóng)的G₀代個(gè)體與野生型個(gè)體單對(duì)雜交，獲得G₁代后，檢測(cè)G₀代的基因編輯情況，保留成功編輯的G₀代與野生型雜交所產(chǎn)生的G₁代個(gè)體，檢測(cè)G₁代基因編輯情況，并將成功編輯的G₁代個(gè)體與野生型雜交產(chǎn)生G₂代，將基因型一致的G₂代個(gè)體自交，在G₃代中可篩選到純合突變體；

優(yōu)選地，為避免脫靶效應(yīng)，G₁代與野生型交配至少5代后，再將雜合突變體自交產(chǎn)生純合突變體。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：獲得了BdorOR43a-1^-/-突變體、BdorOR63a-2^-/-突變體，

所述BdorOR43a-1^-/-突變體是指SEQ?ID?NO.55所示的野生型序列的第224位核苷酸缺失突變；

所述BdorOR63a-2^-/-突變體是在SEQ?ID?NO.56所示的野生型的序列基礎(chǔ)上，第340位后增加了7個(gè)堿基AAGGAAA；同時(shí)野生型序列的第341-343位的三個(gè)堿基“TGC”對(duì)應(yīng)突變體的第348-350位變成了“TTA”。