[發明專利]敲低轉肽酶基因以提高谷氨酰胺轉氨酶產量的方法

在審

• 申請號: 202310012023.3
• 申請日: 2023-01-05
• 公開（公告）號: CN116144566A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 白林泉;吳邦昊;步國建
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12N15/113;C12N15/54;C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明公開了一種敲低轉肽酶基因以提高谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)產量的方法，是通過在茂源鏈霉菌IPIO中，利用CRISPRi/dCas9技術弱化茂源鏈霉菌IPIO中轉肽酶編碼基因的轉錄水平，得到高產TG酶的突變株WBH21。本發明通過降低轉肽酶編碼基因SMDS_318的轉錄水平，抑制了細胞壁的合成以促進物質運輸，提高TG酶分泌效率，以此來提高TG酶的產量。本發明所得的工程菌株WBH21的TG酶發酵產量在實驗室搖瓶水平下較對照菌株提高了54％。通過本發明可顯著提高TG酶的發酵產量，同時使發酵成本大幅度降低。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種敲低轉肽酶基因以提高谷氨酰胺轉氨酶產量的方法，具體說是一種利用CRISPRi/dCas9技術降低SMDS_318的轉錄水平，抑制上述轉肽酶蛋白的表達以提高TG酶發酵水平的方法。

背景技術

TG酶是由茂源鏈霉菌(Streptomyces?mobaraensis)產生的一種單亞基蛋白，它能夠催化蛋白質中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基和賴氨酸的ε-氨基之間進行酰胺基轉移反應，形成ε-(γ-谷酰胺)-賴氨酸的異型肽鍵，從而改變蛋白質的功能性質，被廣泛應用于食品行業蛋白制品食用添加劑、交聯抗體和藥物分子生產抗體偶聯藥物、提高羊毛紡織品的強度等，市場需求量逐年上升，然而目前該酶產量仍然較低，亟待進一步提升。本發明發現，在茂源鏈霉菌生產TG酶的過程中，由于TG酶的交聯作用使菌體細胞壁增厚，阻礙酶原外運等物質運輸過程。進一步的，本發明通過基因組及轉錄組發現了細胞壁形成過程中重要的轉肽酶編碼基因SMDS_318，利用CRISPRi技術降低上述基因的轉錄水平，削弱細胞壁的形成并加強物質運輸過程，最終提高TG酶的產量。

發明內容

本發明的目的在于敲低轉肽酶基因以提高谷氨酰胺轉氨酶產量的方法，具體說是一種抑制轉肽酶SMDS_318表達的方法；通過在茂源鏈霉菌IPIO中利用CRISPRi/dCas9技術降低SMDS_318的轉錄水平，抑制SMDS_318表達，最終可明顯提高谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)產量。

為實現上述目的，本發明提供了以下技術方案：

第一方面，本發明提供了高產TG酶的菌株(WBH21)，所述菌株的轉肽酶基因轉錄被抑制。

作為本發明的一個實施方案，所述菌株為茂源鏈霉菌。

作為本發明的一個實施方案，所述菌株抑制轉肽酶的表達。

作為本發明的一個實施方案，在茂源鏈霉菌IPIO中降低了轉肽酶編碼基因SMDS_318的轉錄水平，抑制了轉肽酶的表達，最終可明顯提高TG酶產量。

第二方面，本發明涉及一種用于敲低轉肽酶基因編碼基因轉錄水平的整合型質粒載體，所述載體降低了轉肽酶編碼基因SMDS_318的轉錄水平，含有靶向上述基因啟動子區域的gRNA，通過降低基因轉錄水平抑制蛋白表達。

作為本發明的一個實施方案，所述轉肽酶編碼基因SMDS_318源于茂源鏈霉菌IPIO。

作為本發明的一個實施方案，所述轉肽酶編碼基因SMDS_318的序列如SEQ?IDNO.1所示，其對應的gRNA_{SMDS_318}的序列如SEQ?ID?NO.2所示。

作為本發明的一個實施方案，所述抑制轉肽酶的表達為CRISPRi干擾基因轉錄水平。

第三方面，本發明涉及一種用于敲低轉肽酶編碼基因轉錄水平的整合型質粒載體的構建方法，包括以下步驟：

在CRISPy-web網站上特異性設計靶向SMDS_318的gRNA，通過PCR擴增得含gRNA_{SMDS_318}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點，獲得整合型質粒載體pLQ2125；