[發(fā)明專利]敲低轉肽酶基因以提高谷氨酰胺轉氨酶產(chǎn)量的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310012023.3
• 申請日: 2023-01-05
• 公開（公告）號: CN116144566A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設計）人: 白林泉;吳邦昊;步國建
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12N15/113;C12N15/54;C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種谷氨酰胺轉氨酶高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述菌株的轉肽酶基因轉錄被抑制。

2.如權利要求1所述的谷氨酰胺轉氨酶高產(chǎn)菌株，其特征在于，在茂源鏈霉菌IPIO中降低了基因SMDS_318的轉錄水平。

3.一種用于降低轉肽酶編碼基因轉錄水平的整合型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述載體抑制了茂源鏈霉菌IPIO的轉肽酶編碼基因SMDS_318的轉錄水平，含有靶向所述轉肽酶編碼基因SMDS_318的啟動子區(qū)域的gRNA，通過降低基因轉錄水平抑制蛋白表達。

4.根據(jù)權利要求3所述的整合型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述轉肽酶編碼基因SMDS_318的序列如SEQ?ID?NO.1所示，其對應的gRNA_{SMDS_318}的序列如SEQ?ID?NO.2所示。

5.一種根據(jù)權利要求3或4所述的整合型質(zhì)粒載體的構建方法，其特征在于，構建步驟如下：

在CRISPy-web網(wǎng)站上設計特異性靶向SMDS_318啟動子區(qū)域的gRNA，通過PCR擴增得到含gRNA_{SMDS_318}基因序列的PCR片段，通過Gibson連接的方法連入整合型質(zhì)粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位點，獲得整合型質(zhì)粒載體pLQ2125。

6.一種高產(chǎn)谷氨酰胺轉氨酶的茂源鏈霉菌菌株，其特征在于，將如權利要求3或4所述的整合型質(zhì)粒載體，或如權利要求5所述的方法構建得到的整合型質(zhì)粒載體通過接合轉移分別導入受體菌茂源鏈霉菌IPIO中，進行位點特異性重組獲得所述菌株。

7.一種提高谷氨酰胺轉氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于，通過CRISPRi技術降低SMDS_318的轉錄水平。

8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，在茂源鏈霉菌IPIO中降低轉肽酶編碼基因SMDS_318的轉錄水平，獲得基因弱化突變株，發(fā)酵，獲得谷氨酰胺轉氨酶。

9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵包括以下步驟：將活化后的弱化突變株孢子接種于種子培養(yǎng)基中，25-30℃、200-220rpm條件下培養(yǎng)24-26h，按6％-10％接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-30℃、200-220rpm的條件下發(fā)酵28-32h。

10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基包括甘油1-3w/v％、酵母提取物0.4-0.8w/v％、魚粉蛋白胨1-3w/v％、MgSO₄·7H₂O?0.1-0.3w/v％、K₂HPO₄·3H₂O0.1-0.3w/v％；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，魚粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO₄·7H₂O?0.1-0.3w/v％，K₂HPO₄·3H₂O?0.1-0.3w/v％，發(fā)酵促進劑0.1-0.4w/v％。