[發明專利]重組腺相關病毒載體制品中rcAAV含量測定方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202211723118.8
• 申請日: 2022-12-30
• 公開（公告）號: CN116004921A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 李秀;牛苗;王玉松;潘顯輝
• 申請（專利權）人: 北京五加和基因科技有限公司;北京錦籃基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

本發明涉及重組腺相關病毒載體樣品中rcAAV含量的檢測方法，所述方法的特征在于：使用4至5mL容量的細胞培養瓶培養細胞并在不損失rcAAV的情形下對細胞進行三輪或以上感染，然后使用SEQ?ID?NO:1和2所示的rep2基因特異性引物和SEQ?ID?NO:3所示的Taqman探針對第一輪和最后一輪的感染收獲的超濾濃縮液實施定量PCR檢測，由此獲得重組腺相關病毒載體樣品中rcAAV含量。本發明還涉及用于實施本發明的重組腺相關病毒載體樣品中rcAAV含量的檢測方法的試劑盒。

技術領域

本發明涉及重組腺相關病毒載體制品的質量檢測領域。具體而言，本發明涉及重組腺相關病毒(adeno-associated?virus，AAV)載體制品中rcAAV含量的測定方法以及用于測定rcAAV含量的檢測試劑盒。

背景技術

腺相關病毒(adeno-associated?virus，AAV)載體無致病性，免疫原性低，安全性好，能轉導種類眾多的組織細胞，并能長期穩定地表達其攜帶的基因，這些特性使其十分適合于作為體內基因轉移的工具。重組腺相關病毒(recombinant?AAV，rAAV)載體是一種具有高靶向性和良好安全性的病毒載體，在基因治療中得到了較為廣泛的應用。

目前構建重組AAV載體通常使用目的基因替換野生型腺相關病毒基因組中的rep基因、cap基因，再將重組基因組包裝到有感染性的病毒顆粒中。重組AAV載體通過AAV?ITR與反式存在于輔助成分或生產細胞中的rep基因和cap基因序列之間的同源或非同源重組的機制，在重組AAV載體生產期間可能形成復制型腺相關病毒(Replication?CompetentAAV,rcAAV)。近期的動物實驗表明，rcAAV中cap基因在體內的表達會引發嚴重的免疫反應，且包裝有其他DNA雜質的rcAAV還具有致瘤性或引入抗生素抗性的潛在風險。因此，重組AAV載體生產的組件應設計為可以消除rcAAV產生的可能，并且臨床使用的rAAV載體產品需要對rcAAV進行檢測，以嚴格控制rAAV載體制品中rcAAV的污染。

rcAAV作為rAAV載體制品生產過程中的產品相關雜質，對其限度尚未有明確的標準要求。重組AAV-2/人凝血因子IX注射液質量標準中規定：在1E+06vg的rAAV-hFIX中，rcAAV顆粒數(即，基因組拷貝數)不超過1個，檢測方法為PCR法(《生物技術藥物研究開發和質量控制(第三版)》)。

隨著基因治療技術的發展，研究者開發出qPCR法檢測rcAAV基因組拷貝數，但是qPCR法擴增的rcAAV基因組不一定具有復制或感染活性。因此qPCR法無法真正的確定rcAAV含量。此外，qPCR法檢出限受rAAV制品濃度限制，無法檢測低濃度rAAV制品中殘余rcAAV基因組拷貝數，例如用于生產過程中對中間產品的質量控制。

對于AAV2血清型載體，可以使用感染中心測定法(infectious?center?assay)進行具有復制活性的rcAAV殘余檢測。由于大多數非AAV2血清型載體制品中的rcAAV觀察到對于體外培養細胞的感染效率較低，開發非AAV2血清型載體制品中的rcAAV測定是一個挑戰。