[發明專利]重組腺相關病毒載體制品中rcAAV含量測定方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202211723118.8
• 申請日: 2022-12-30
• 公開（公告）號: CN116004921A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 李秀;牛苗;王玉松;潘顯輝
• 申請（專利權）人: 北京五加和基因科技有限公司;北京錦籃基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

1.重組腺相關病毒載體樣品中的rcAAV含量檢測方法，包括如下步驟：

(1)使用約4至5mL容量的細胞培養瓶，例如T25培養瓶，培養細胞；

(2)將以下各組接種物加入至分別的所述細胞培養瓶中，進行細胞的第一輪感染：

i)陽性對照組(PC)：為輔助病毒和rcAAV標準品，其中，輔助病毒用于rcAAV標準品的復制，且rcAAV標準品為約1E+3vg至4E+5vg?rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg?rcAAV；

ii)加標組(Spike)：為輔助病毒和rcAAV標準品，以及受檢樣品，其中，輔助病毒用于rcAAV標準品的復制，且rcAAV標準品為約1E+3vg至4E+5vg?rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg?rcAAV；受檢樣品為約1E+08vg至1E+11vgAAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg?AAV；

iii)受檢樣品組(Test)：為輔助病毒和受檢樣品，其中，受檢樣品為約1E+08vg至1E+11vg?AAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg?AAV；

(3)第一輪感染結束后，將所述各培養瓶中的細胞及上清凍融，并將各培養瓶中的全部細胞及上清轉移至分別的離心管中，56℃滅活后，超濾濃縮至1mL；取約500μL濃縮液于≤-70℃保存，用于qPCR檢測；另約500μL濃縮液作為下一輪感染接種液；

(4)將第一輪感染后獲得的各約500μL濃縮液加入約4mL新鮮的培養基中，進行第二輪細胞感染，與步驟(3)同樣地，各培養瓶獲得1mL超濾濃縮液，全部用于下一輪感染；

(5)第三輪感染(任選地，第四輪感染)與第二輪感染操作相同；在第三輪感染(任選地，第四輪感染)結束后，各培養瓶獲得1mL超濾濃縮液全部用于qPCR檢測；

(6)完成三輪(任選地，四輪)感染后，自第一輪和最后一輪感染收獲的超濾濃縮液提取DNA，作為實施qPCR的DNA模板，以Rep基因為模板設計特異性引物以及Taqman探針，進行qPCR檢測；

(7)結果分析及判定：

如果陽性對照組(PC):第一輪Ct均值＞最后一輪Ct均值；

加標組(Spike)：第一輪Ct均值＞最后一輪Ct均值；

且受檢樣品組(Test)：第一輪Ct均值＜最后一輪Ct均值，則受檢樣品中rcAAV含量為：＜rcAAV標準品加入量/AAV樣品加入量(vg)；

如果陽性對照組(PC):第一輪Ct均值＞最后一輪Ct均值；

加標組(Spike)：第一輪Ct均值＞最后一輪Ct均值；

且受檢樣品組(Test)：第一輪Ct均值＞最后一輪Ct均值，則需進一步稀釋受檢樣品并實施步驟(1)至(6)的檢測，直至檢測到受檢樣品組(Test)：第一輪Ct均值＜最后一輪Ct均值，則受檢樣品中rcAAV含量為：rcAAV標準品加入量/稀釋的AAV樣品加入量(vg)。