[發(fā)明專利]一種篩選高蝦青素產(chǎn)量的紅法夫酵母的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211722969.0
• 申請(qǐng)日: 2022-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116286412A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張志榕;高華清;黃明星;周學(xué)強(qiáng);戴權(quán);彭成洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京金泰毅農(nóng)作物科技有限公司;江西紅土地化工有限公司;毅植農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/16
• 分類號(hào): C12N1/16;C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發(fā)明涉及一種篩選高蝦青素產(chǎn)量的紅法夫酵母的方法，具體步驟如下：S1、紅法夫酵母培養(yǎng)：將處理后的紅法夫酵母菌液稀釋之后涂布至固體培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)；S2、加入指示菌：配置MRS瓊脂培養(yǎng)基，降溫后接種乳酸菌，加入乳酸菌抑制劑，混勻后覆蓋于步驟S1中生長(zhǎng)有紅法夫酵母的固體培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)；S3、篩選目標(biāo)菌：觀察步驟S2中固體培養(yǎng)基的情況，從該固體培養(yǎng)基中篩選乳酸菌生長(zhǎng)面積最大菌落，挑取其下方的紅法夫酵母，傳代純化后使用高效液相色譜法測(cè)定紅法夫酵母的蝦青素含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用乳酸菌作為指示菌，根據(jù)乳酸菌生長(zhǎng)的面積來(lái)判斷誘變后紅法夫酵母產(chǎn)生的蝦青素的量，比肉眼判斷顏色更加客觀、準(zhǔn)確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種篩選高蝦青素產(chǎn)量的紅法夫酵母的方法。

背景技術(shù)

蝦青素是一種類胡蘿卜素類物質(zhì)，廣泛的存在于鮭魚(yú)、甲殼類和鳥(niǎo)類中，其具有強(qiáng)大的抗氧化能力，在食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、飼料等行業(yè)中有著巨大的應(yīng)用前景。

現(xiàn)如今，蝦青素的生產(chǎn)方式主要有化學(xué)合成法、提取法和微生物發(fā)酵法三種方式。化學(xué)合成法價(jià)格昂貴，且合成的蝦青素多為順式結(jié)構(gòu)，和天然蝦青素存在顯著差異，不利于動(dòng)物體吸收；提取法主要是從甲殼類動(dòng)物加工下腳料中提取蝦青素，提取前必須除去廢棄物中的石灰質(zhì)成分，生產(chǎn)條件要求苛刻，生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量較低、產(chǎn)品純度不高。而微生物發(fā)酵法主要有兩種方式：一是利用藻類生產(chǎn)；二是利用紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)，其中，紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)的蝦青素由于其天然無(wú)污染受到了廣泛關(guān)注，但天然的紅法夫酵母原始菌株產(chǎn)色素能力較低，蝦青素含量為100-300mg/kg干細(xì)胞左右。這種情況離大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)要求較遠(yuǎn)。為提高其產(chǎn)量，一個(gè)重要的方法是使用各種物理或化學(xué)因子對(duì)紅法夫酵母進(jìn)行誘變處理，并對(duì)誘變后的紅法夫酵母進(jìn)行篩選來(lái)選育高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株，而由于采取隨機(jī)誘變時(shí)，需要在眾多的菌株中準(zhǔn)確篩選出目標(biāo)菌株，所以一種能準(zhǔn)確、直觀的篩選方法尤為重要。

中國(guó)專利CN202111175715.7公開(kāi)了一種高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株的選育方法，該方法包括以下步驟：(1)菌種活化；(2)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液的制備；(3)菌懸液的制備；(4)ARTP誘變；(5)β-紫羅酮篩選；(6)菌株復(fù)篩；(7)連續(xù)傳代。β-紫羅酮篩選的具體過(guò)程為：將ARTP誘變菌懸液梯度稀釋，然后涂布至加有β-紫羅酮的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選紅色色澤深的色素產(chǎn)量高的菌株，得到初篩菌株。該專利使用β-紫羅酮對(duì)紅法夫酵母菌株進(jìn)行篩選，并通過(guò)肉眼判斷顏色。

中國(guó)專利CN201611231901.7公開(kāi)了一種高產(chǎn)蝦青素的突變菌株及其應(yīng)用，該專利從落葉上篩選到的自然菌株紅法夫酵母XQ，其蝦青素產(chǎn)量為55.77mg/mL。該專利進(jìn)一步通過(guò)紫外誘變和2-脫氧-D-葡萄糖篩選獲得的突變菌紅法夫酵母XQS，其蝦青素產(chǎn)量得到顯著提高，達(dá)78.42mg/mL，比出發(fā)菌紅法夫酵母XQ提高了40.6％，且遺傳性狀穩(wěn)定。但該專利的篩選方法也依賴于顏色觀察，導(dǎo)致篩選結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性降低。

中國(guó)專利CN201610988129.7公開(kāi)了一種快速篩選高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母菌株的方法，包括以下步驟：1)野生型紅法夫酵母菌株活化后恒溫培養(yǎng)箱中22～25℃培養(yǎng)，取少量單菌落加入種子培養(yǎng)基中，120～130r/min搖床培養(yǎng)；2)常壓恒壓室溫等離子束(ARTP)誘變野生型紅法夫酵母菌株150～180s；3)誘變后菌液轉(zhuǎn)入離心管中，梯度稀釋，涂平板；4)菌株轉(zhuǎn)接到24孔板，搖床培養(yǎng)45～50h，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，篩選候選突變菌株；5)種子培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)；6)種子液成比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)；7)超聲法提取蝦青素，超聲時(shí)間為1～1.2h，高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中蝦青素含量；8)篩出高產(chǎn)蝦青素突變株，產(chǎn)率較野生型提高了25～55％。但該專利的篩選方法也依賴于顏色觀察，導(dǎo)致篩選結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性降低，且細(xì)胞熒光強(qiáng)度復(fù)篩也使得篩選過(guò)程復(fù)雜化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種篩選高蝦青素產(chǎn)量的紅法夫酵母的方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：